周坛雷，张淑平，赵振翔，赵 娇，齐 光，李建峰

肺癌为全球范围内癌症死亡的首要原因，非小细胞肺癌(NSCLC)为肺癌最常见类型，发生率约为肺癌的80%，肿瘤局部复发或远处转移为影响NSCLC长期生存的首要原因，其中颅脑为NSCLC患者最常累及且最严重的转移部位[1]。NSCLC患者脑转移发生和发展十分隐蔽，出现症状后治疗十分困难，因此判断NSCLC脑转移高发人群并找出预测脑转移发生、发展的生物学指标，一方面可对高危人群进行预防以减少脑转移的发生，另一方面可早期诊断脑转移并及时进行治疗以改善患者预后[2-3]。随着医学技术的不断发展，人们对NSCLC的研究逐渐深入至基因遗传组学和分子生物学，肿瘤标志物被广泛应用于疾病诊断和预后评估中[4]。核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，可在氧化和外源性应激刺激下通过调节细胞适应性来保护细胞，维持细胞氧化还原稳态，其表达情况与恶性肿瘤发生和发展关系密切，但临床关于其在NSCLC脑转移中的表达及意义研究较少[5-6]。本研究对NSCLC脑转移患者Nrf2基因和蛋白表达情况进行分析，探讨其对NSCLC脑转移患者的影响及预测价值。现报告如下。

1.1一般资料 将我院2019年9月—2021年9月收治的NSCLC脑转移65例作为脑转移组，另将同期于我院治疗的NSCLC非脑转移65例作为非脑转移组。纳入标准：符合NSCLC诊断标准[7]，并经病理组织学确诊；
原发性NSCLC；
脑转移组经头颅影像学检查证实存在脑转移；
年龄≥18岁；
签署知情同意书。排除标准：伴有其他恶性肿瘤；
合并严重心、肝、肾等功能障碍；
免疫缺陷、血液系统疾病；
有肺部手术史；
合并严重肺源性心脏病、慢性支气管炎等疾病。本研究获我院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1基础资料收集：收集入院时2组性别、年龄、肿瘤原发部位、病理类型、组织学分级、T分期、N分期资料。其中肿瘤原发部位包括主支气管、肺上叶、肺中叶、肺下叶；
病理类型分为腺癌、非腺癌(包括肺泡癌、低分化癌、大细胞癌、鳞癌、腺鳞癌等)；
肿瘤分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)的TNM分期手册(第七版)[8]：T分期分为T1～T3期、T4期，N分期分为N0～N1期、N2～N3期。

1.2.2Nrf2基因和蛋白表达检测：①应用患者入院时取得的肺癌病理组织，采用全基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)提取RNA，以荧光实时定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，试剂盒购自Takara公司，取扩增反应液5 μl，2%琼脂糖凝胶电泳20 min后，使用凝胶成像系统拍照，以Quantity One软件分析图像，比较各泳道PCR产物和β-actin光密度之比，作为Nrf2 mRNA表达量，核酸序列参照美国国家生物技术信息中心网站的人类基因参考序列，引物序列(5"-3")：上游：AGCCCAGCACATCCAGTCAG，下游：TGCATGCAGTCATCAAAGTACAAAG。②免疫组织化学法检测Nrf2蛋白：患者入院时取肺癌组织，常规石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，置于烤箱中在60 ℃下烤片6 h，采用链霉素标记的辣根过氧化物酶和生物素标记的第2抗体及底物色素混合液测定组织中的抗原，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，滴加抗原修复液(北京索莱宝科技公司)，将一抗以适宜比例稀释，滴加适量稀释后一抗至组织切片上，放置4 ℃冰箱过夜，后于室温37 ℃下孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加二抗(武汉博士德生物有限公司)，37 ℃下孵育30～60 min，PBS冲洗3次，每次5 min，DAB(试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZLI-9018)显色5 min，光学显微镜下观察组织切片，以半定量积分法分析切片结果，结果评分由着色强度水平和着色的阳性细胞数决定，着色强度：无染色为0分，浅黄色为1分，黄褐色为2分，棕黄色为3分；
阳性细胞数：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。着色强度水平和着色的阳性细胞数相加所得为染色总分，总分1分为阴性，2～6分为阳性。

1.3观察指标 比较2组入院时肺癌组织的Nrf2 mRNA和蛋白表达情况；
分析Nrf2 mRNA对NSCLC患者发生脑转移的预测价值；
分析NSCLC患者发生脑转移的危险因素。

2.1基础资料 2组性别、肿瘤原发部位、组织学分级比较差异无统计学意义(P>0.05)；
脑转移组年龄≥60岁、腺癌、T分期为T4期、N分期为N2～N3期、Nrf2蛋白阳性表达患者占比高于非脑转移组，Nrf2 mRNA表达水平高于非脑转移组(P<0.01)。见表1。

表1 脑转移与非脑转移NSCLC患者基础资料比较

2.2Nrf2 mRNA预测NSCLC患者发生脑转移的价值 经ROC曲线分析，Nrf2 mRNA预测NSCLC患者发生脑转移的曲线下面积、敏感度、特异度分别为0.829、0.785、0.769。见图1。

2.3NSCLC患者发生脑转移的影响因素 将单因素分析差异有统计学意义的指标纳入多因素Logistic回归分析模型，行量化赋值，因变量为NSCLC患者是否发生脑转移(是=1，否=0)，自变量为年龄(≥60岁=1，<60岁=0)、病理类型(腺癌=1，非腺癌=0)、T分期(T4期=1，T1～T3期=0)、N分期(N2～N3期=1，N0～N1期=0)、Nrf2 mRNA(≥1.149=1，<1.149=0)、Nrf2蛋白表达(阳性=1，阴性=0)。经多因素Logistic回归分析，年龄≥60岁、腺癌、T分期为T4期、N分期为N2～N3期、Nrf2 mRNA≥1.149、Nrf2蛋白阳性表达是NSCLC患者发生脑转移的危险因素(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 NSCLC患者发生脑转移的多因素Logistic回归分析

脑转移瘤为成人最常见颅内肿瘤，其发病率约为颅内原发性肿瘤的4～5倍，脑转移瘤三大原发性恶性肿瘤依次为肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤，而NSCLC患者中约有30%会发生脑转移，该部分患者预后差，生存率低[9-12]。由于血脑屏障的存在，传统化疗药物治疗脑转移瘤效果有限，放疗成为脑转移瘤主要治疗方式，但患者生存时间仍不足1年，因此找到可预测NSCLC患者脑转移发生和发展的指标，对临床早期筛查、诊断和治疗脑转移瘤具有重要意义[13]。随着医疗诊断技术的不断发展，各种肿瘤标志物逐渐在临床推广应用，其不仅可用于NSCLC患者诊断和预后评估，而且在预测和治疗脑转移瘤中的应用价值也值得探讨[14]。

本研究中，脑转移组年龄≥60岁、腺癌、T分期为T4期、N分期为N2～N3期、Nrf2蛋白阳性患者占比高于非脑转移组，Nrf2 mRNA表达水平高于非脑转移组。提示上述因素可能为NSCLC患者发生脑转移的影响因素。既往已有报道指出年龄为NSCLC患者发生脑转移的独立危险因素[15]。此外，NSCLC腺癌主要以浸润式生长为主，且易出现血行转移，中枢神经系统转移发生率较高[16]；
T分期、N分期越高的患者肿瘤细胞分化程度越低，恶性程度越高，癌细胞侵袭性越强，脑转移可能性越高[17-18]。

Nrf2是细胞氧化应激反应中关键转录因子，可维持细胞氧化还原平衡稳态，形成细胞自我保护机制，发挥抗损伤效果，其高表达可降低细胞氧化应激和亲电性应激导致的细胞损伤[19]；
Nrf2可对抗肿瘤形成初期细胞内外压力，在一定程度抑制细胞癌变，但肿瘤发生后，Nrf2异常活化，癌细胞可利用Nrf2对细胞的保护机制来排除恶性增殖过程中产生的有害物质，促进肿瘤细胞增殖，并帮助肿瘤细胞抵抗放化疗造成的有毒有害物质，降低放化疗效果[20]；
Nrf2活性受胞质蛋白(Keapl)负调控，通常情况下Keap1功能区将泛素连接酶E3复合物与Nrf2结合，Nrf2活化后，Nrf2与Keapl解离进入细胞核，在核内与Maf蛋白形成异二聚体，后与抗氧化反应元件靶基因启动子结合，调控下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白表达，介导信号通路炎症、癌细胞生存和增殖等病理过程，促进肿瘤发展[21]。也有研究指出Nrf2蛋白表达与肿瘤浸润深度、临床分期、病变直径、组织分化具有明显相关性，Nrf2高表达患者癌细胞增殖能力较强，侵袭程度较高，出现转移风险较高[22]。

本研究多因素Logistic回归分析证实，年龄≥60岁、腺癌、T分期为T4期、N分期为N2～N3期、Nrf2 mRNA≥1.149、Nrf2蛋白阳性表达是NSCLC患者发生脑转移的危险因素。因此对具有上述特征的患者临床应密切监测并及时进行干预，以降低脑转移发生风险，控制患者病情发展。

综上，年龄≥60岁、腺癌、肿瘤分期越高的NSCLC患者发生脑转移风险越高，Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白表达情况与脑转移发生密切相关。

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