陈 洁

（宁德市食品药品检验检测中心，福建 宁德 352100）

雌性激素（estrogen）又称女性激素，分为雌激素和孕激素两大类，是女性重要的荷尔蒙。适当补充低剂量的雌性激素可达到改善皮肤状态、延缓老化、刺激并维持女性第二性征（如促使乳房发育、增大）、增强骨骼硬度、降低落齿率等效果[1-4]，也可减轻女性更年期潮红出汗、心慌气急、烦躁易怒等症状[5-7]。现代医学研究表明，通过食物也可补充雌性激素，个别雌性激素严重偏低者可在医生指导下服用雌性激素药品；
但不可擅自补充，服用不当者可能导致身体内分泌失调，损伤生殖器官，增加罹患乳腺肿瘤和子宫内膜病变几率的风险[8-13]。

由于女性生活节奏、工作节奏加快，更年期提前、睡眠不好、压力大、焦躁不安等问题也随之出现[14-17]。市面上宣称有改善睡眠、美容养颜、延缓衰老的保健食品也受到这部分消费者的欢迎。一些不法商家追求低成本、见效快、功能强的目的，很可能在此类保健产品中添加雌性激素类化学药物，危害消费者身体健康。

目前，国内尚未出台保健食品中雌性激素检测的相关标准。文献报道的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[18-21]，气相色谱-质谱联用法[22-24]，高效液相色谱法[25-27]、酶联免疫法[28-29]、荧光法[30-31]等。液相色谱仪因其价格相对便宜，准确度、精密度高，操作简便、快速，因而受到更广泛应用，是近年研究的主要方向。本文建立了高效液相色谱法同时测定保健食品中5种雌性激素，对完善保健食品检验标准体系、为市场监管提供技术依据。

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪[配有DAD检测器，安捷伦科技（中国）有限公司]；
XPE 105电子天平（Mettler Toledo）；
SQP电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；
WP-UP-YJ-20S超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。

1.2 材料

对照品信息：见表1。乙腈、甲醇：色谱纯；
实验用水：一级水。样品为市售女士口服液。

表1 对照品信息

2.1 溶液制备

2.1.1 标准溶液配制 标准储备液：取对照品适量，精密称定，置入50 ml量瓶，甲醇定容至刻度线，混匀，得1 mg/ml的标准储备液。

标准使用液：临用前，准确移取上述1 mg/ml标准储备液1 ml置入10 ml量瓶，甲醇定容至刻度线，混匀，得 100 μg/ml的标准使用液。

2.1.2 样品前处理 准确称取样品1 g（精确到0.001 g）置入10 ml具塞离心管，加入5 ml甲醇，超声10 min，取出，用甲醇定容至刻度线，经0.45 μm有机滤膜过滤后上机测定。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇-乙腈-水（60:20:20）；
流速：0.8 ml/min；
检测波长：230 nm；
进样量：10 μl；
柱温：40 ℃。

2.3 色谱条件优化

分别对比样品甲醇溶液、5种雌性激素混合标准溶液（浓度为10 μg/ml）和加入雌性激素标样的样品甲醇溶液（浓度为10 μg/ml），用不同的流动相（甲醇-水，乙腈-水以及甲醇-乙腈-水）进样测试，观察各组分分离效果。结果表明，以甲醇-乙腈-水=60:20:20作为流动相，流速0.8 ml/min时，可达到理想的分离效果，色谱图见图1～图3。

图1 5种雌性激素混合标准溶液的色谱图

图2 样品甲醇溶液的色谱图

图3 加入雌性激素标样的样品甲醇溶液的色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 检出限、定量限及线性关系的考察 准确移取适量100 μg/ml标准使用液，用甲醇稀释成浓度为5，10，20，30和50 μg/ml系列标准工作溶液，按2.2项色谱条件检测，以目标物浓度（X，μg/ml）为横坐标，相应的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线；
以3倍信噪比确定方法检出限，10倍信噪比确定方法定量限。结果见表2。

表2 5种雌性激素的线性方程、相关系数、检出限和定量限

由表 2 可见，在 5～50 μg/ml浓度范围内，5种雌性激素的线性方程相关系数 r2≥0.999 91，线性关系良好；
方法检出限为 0.24～0.84 mg/kg，定量限为0.80～2.82 mg/ kg，表明本法灵敏度好，准确度高。

2.4.2 精密度和稳定性 在6个空白样品中添加适量标准使用液，使每个空白样品中最终加标浓度为10 μg/ml，按照2.1.2项制备样品，按2.2项色谱条件测定，记录出峰时间及峰面积；
并在0，2，5，8，10，24 h 各进样1次，记录不同时间段各目标物的峰面积变化，计算相对标准偏差。结果见表3。

表3 5种雌性激素的精密度和稳定性

由表 3 可见，加标浓度为10 μg/ml的6个平行样中5种雌性激素的峰面积RSD为0.17 %～0.25 %，保留时间RSD为0.10 %～0.14 %，无明显变化；
24 h内5种雌性激素的峰面积RSD为0.12 %～0.22 %，峰面积变化相对稳定。综上，表明本试验方法精密度佳，稳定、重现性良好，可适用于保健品中5种雌性激素的检测。

2.4.3 方法回收率 在空白样品中添加3种不同浓度的标准混合溶液，按2.1.2制备样品，按2.2色谱条件进行6水平测定，计算各目标物回收率。结果见表4。

表4 5种雌性激素的平均回收率和相对标准偏差表（n=6）

由表4可见，各目标物回收率为90.0 %～103.1 %，RSD为0.98 %～1.27 %，满足GB/T 27404-2008的质控要求。进一步说明本法准确度高，精密度好，满足保健品中5种雌性激素同时测定的要求。

2.5 样品测定

采用本研究建立的方法，对市售10批次宣称具有祛斑、美容养颜功效的女士口服液进行分析检测，结果表明，5种雌性激素含量均低于检出限。

本研究建立了一种同时测定女士口服液中雌三醇、己烯雌酚、雌二醇、雌酮和黄体酮等5种雌性激素含量的高效液相色谱方法。该法操作简便，准确度高，重现性好，灵敏度强，能有效提高保健食品中雌性激素的检测效率，为市场监管部门提供技术依据。本次检测的市售10批次宣称具有祛斑、美容养颜功效的女士口服液，5 种雌性激素含量均低于检出限，表明在法律和相关部门的监管下，抽检样品中未发现假劣药物和保健品非法添加情况。仍提醒消费者应通过正规渠道购买保健食品，如发现制假售假或购买到有问题商品应及时向政府部门报告。

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