宋学文 李文玲 朱丽雯 PRITHIVIRAJ Nagarajan 王 军 严继舟1,

(1. 上海海洋大学海洋生态系统和神经科学研究所, 上海 201306; 2. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306)

烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)存在于许多组织中, 是糖酵解的限速酶, 除在葡萄糖代谢过程中催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸外, 根据其细胞定位还参与多种生理和病理过程[1]。在糖酵解代谢, Warburg效应是肿瘤异常代谢的主要特征之一, 肿瘤细胞借助这一异常能量代谢可以逃避正常的细胞凋亡, 来进行增殖和迁移[2]。Warburg效应中葡萄糖代谢以糖酵解方式为主, 并抑制线粒体的氧化磷酸化[3]。比如ENO1在卵巢癌和胃癌组织中呈现高表达[4,5]; ENO1在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭[6,7]。但也有研究表明ENO1在非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC)组织中表达的上调与临床结果相关性不大[8,9]。Chang等[10]的研究表明, 非小细胞肺癌中ENO1蛋白水平明显降低, ENO1过表达抑制了A549细胞系向上皮间充质的转变(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。这些结果表明ENO1是一个多功能蛋白。

蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是蛋白质功能调节的一种重要方式, 对蛋白质的结构和功能起着至关重要的作用[11]。蛋白质翻译后修饰几乎参与细胞的所有生命活动过程, 发挥着非常重要的调控作用。常见的修饰方式包括甲基化、磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化、SUMO 化、亚硝基化和氧化等。绝大部分的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰, 某些疾病常常与一些蛋白质异常的修饰有关。修饰基团的加入, 可能会引起蛋白质理化性质、结构和空间构象的改变, 从而引起蛋白质功能的改变, 进而引发某些疾病。特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标[12]。

生物活性肽是一类能够调节生物体生理功能的多肽, 参与神经调节、抗癌、免疫调节、激素递质调节、新陈代谢、营养保健、抗氧化和延缓衰老等[13,14]。从肽转运可能性到双甘肽跨膜转运现象再到寡肽吸收机制实验证实蛋白质能以肽的形式被人体利用和吸收。相比于蛋白质等大分子, 多肽更容易被机体吸收, 因此被广泛应用于生物活性多肽功能和营养学的研究。本实验室前期在研究海星活性成分过程中, 利用蛋白质质谱检测多肽种类, 通过蛋白质谱结果和文献筛选追踪到ENO1多肽。我们推测ENO1的不同功能是由ENO1活性多肽的不同化学修饰引起的。本文通过合成甲基化、乙酰化、磷酸化修饰及不经过修饰的ENO1多肽片段, 探究ENO1蛋白的生化功能和对细胞生长的影响。

1.1 细胞株和主要实验材料

细胞系: PAC2斑马鱼胚胎成纤维细胞[15,16], 从美国国立卫生研究院(NIH)引进。甲基化、乙酰化、磷酸化修饰和未修饰的ENO1多肽(ENO1多肽序列: EG-Me: ELRDNDK(Me)TPYLGKG; EG-Ac:ELRDNDK(Ac)TPYLGKG; EG-Ps: ELRDNDK(Ps)TPYLGKG; EG: ELRDNDKTRYLGKG)由强耀生物公司合成。Leibovitz’s L-15 培养基、胎牛血清、含酚红的2.5%胰酶为美国Gibco公司产品,CCK-8细胞增殖检测试剂盒(Cat.No.C0037)、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(Cat.No.C0016)为碧云天生物科技有限公司产品, 线粒体染色试剂盒(Cat.No.E607509)、溶酶体染色试剂盒(Cat.No.E607506)为上海生工生物有限公司产品。2-Phosphoglycerate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(Cat.No.MAK198)为Sigma-Aldrich公司产品。RT2ProfilerTMPCR Array试剂盒(Cat. No. PAZF-006Z ), RT² SYBR®Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529) 和RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104)为Qiagen Germany公司产品, PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Cat. No. RR037B)为TaKaRa公司产品。

1.2 四种多肽对细胞的处理

取对数生长期的PAC2斑马鱼胚胎成纤维细胞,用含10%胎牛血清的L15培养基调整细胞悬液密度为1×105ind./mL, 向96孔板或LAB-TEK板每个孔中加入100 μL细胞悬液, 置于32℃培养箱中培养。Dai等[17]的研究结果表明海星的甲醇水层提取物在100 μg/mL的浓度下处理细胞24h作用效果较好。因此, 待细胞密度达到80%左右, 用不含血清的细胞培养液(Leibovitz’s L-15 培养基)分别将4种多肽稀释至100 μg/mL, 培养PAC2细胞24h。以不含多肽的稀释液培养细胞为空白对照, 所有实验有3个平行。

1.3 CCK-8法检测PAC2细胞增殖能力

向上面细胞培养的96孔板每孔加入10 μL CCK-8和90 μL无血清的L15培养基, 32℃孵育过夜。用酶标仪(Microplate reader)在450 nm处测定各孔的吸光度(OD)值。

1.4 胞内、胞外乳酸脱氢酶(LDH)释放的检测

糖酵解过程中生成的丙酮酸在LDH的催化下还原为乳酸。LDH试剂盒检测中: LDH可使1种四唑盐INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyltetrazolium chloride)转化为强生色的红色甲瓒, 生成的红色产物的量与LDH的含量成正比, 在490 nm波长下产生吸收峰, 从而可以通过比色法来定量乳酸脱氢酶的活性。实验操作按照试剂盒说明书进行。先用4种多肽处理细胞24h进行预实验, 确定后续裂解的细胞组(样品最大酶活性孔)。到预定检测时间的前1h, 在“样品最大酶活性对照孔”中加入10 μL LDH释放试剂、混匀, 孵育。到达预定时间后, 将细胞培养板400 r/min离心5min。取上清液120 μL, 进行胞外LDH检测。细胞沉淀加入150 μL用PBS稀释了10倍的LDH释放工作液试剂(10体积1×PBS中加入1体积LDH释放试剂并混匀), 适当摇晃混匀, 32℃孵育1h, 到达预定时间后, 400 r/min离心5min, 取120 μL上清用于细胞内总LDH的检测。分别向胞外和胞内LDH检测样本中, 加入60 μL LDH检测工作液(乳酸溶液﹕1×INT溶液﹕酶溶液=1﹕1﹕1), 混匀。室温避光孵育2h, 用酶标仪(Microplate reader)在490 nm测吸光度值。细胞LDH释放率=(多肽处理后细胞上清液OD–对照组细胞上清液OD)/(最大酶活性组细胞培养液OD–对照组上清培养液OD)×100%。

1.5 线粒体和溶酶体完整性检测

将对数生长期的PAC2斑马鱼胚胎成纤维细胞用胰酶消化后取细胞悬液(1×105ind./mL)接种到LAB-TEK板中, 按上述的多肽处理方法用100 μg/mL的4种多肽分别处理PAC2细胞并培养24h。线粒体和溶酶体染色: 用1×PBS清洗细胞2—3次, 加入200 μL溶酶体(红色)和线粒体(绿色)工作液32℃孵育1h。然后弃染色液, 用L15培养基﹕PBS=1﹕1的缓冲液洗涤2次。用TRITC和FITC滤光器的荧光显微镜(OLYMPUS TH4-200)观察细胞并拍照。

1.6 2-磷酸甘油酸(2-PG)检测

2-PG的含量是通过将2-PG转化为PEP再转化为丙酮酸来确定的。丙酮酸被氧化, 产生的荧光强度(Ex/Em=535/587 nm)与2PG含量成正比。利用2-PG试剂盒可以检测ENO1修饰后的4条多肽对糖酵解代谢的终极产物丙酮酸生成的影响。

先建立标准曲线: 用975 μL超纯水稀释25 nmol/L(1 mmol/μL)的2-磷酸甘油(2-PG)至工作浓度为25 μmol/L(25 pmol/μL)的2-PG 标准品, 添加0、2、4、6、8和10 μL的2-PG标准品工作液, 使最终浓度为0、50、100、150、200和250 pmol/孔。然后加2-PG Buffer至每个使最终体积为50 μL。用4种多肽处理PAC2细胞24h后, 将96孔板从培养箱中取出,移走培养基, 用PBS清洗2次。每个孔用50 μL胰酶消化贴壁细胞3min, 显微镜观察细胞变圆后加入含10%FBS的L15培养基终止消化, 转移至离心管,1000×g离心3min, 弃培养基。加入100 μL 的1×PBS清洗细胞。离心沉淀加入200 μL预冷的2-PG Assay Buffer, 超声破碎并匀浆, 12000×g离心5min, 将上清液移至另一个新的96孔板中, 每孔中50 μL的荧光反应体系混合液, 室温避光孵育40min。酶标仪在Ex/Em=535/587 nm下测荧光值。2-PG浓度C=Sa/Sv(Sa. 从标准曲线中得到未知样品中2-PG的含量; Sv. 检测的样品体积)

1.7 RNA提取及PCR Array分析葡萄糖代谢通路

总RNA提取和cDNA合成用0.25%的胰酶消化收集4种不同修饰多肽处理24h后的细胞悬液,利用TRIzol法提取细胞total RNA, 并去除基因组DNA; cDNA的合成: 按照TaKaRa公司的PrimeScript™II High Fidelity RT-PCR Kit试剂盒方法进行反转录合成cDNA。–20℃保存备用。

PCR ARRAY利用PCR ARRAY通过Real-Time PCR分析参与葡萄糖代谢过程中84个关键基因的表达。每个编目的RT2Profiler PCR阵列中包含葡萄糖代谢的84个关键基因和5个管家基因。将上述合成的cDNA用于real-time RT2Profiler PCR Array (QIAGEN, Cat. No. PAZF-006Z)与RT2SYBR®Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529)检测。将CT值导出到Excel文件, 以创建CT值表。该表随后上传至QIAGEN官方数据分析门户网站http://www.qiagen.com/geneglobe, 将样本分配给对照组和试验组。从GeneGlobe的QIAGEN门户网站导出相应数据分析报告。

1.8 转录组测序

基于以上结果, 选取空白对照处理和乙酰化修饰多肽处理24h之后的PAC2细胞进行转录组分析。利用TRIzol法提取total RNA, 由金唯智生物科技有限公司（现改名为“安升达生命科学技术公司”）进行RNA-seq测序, 采用Illumina测序平台完成转录组测序, 构建Illumina PE文库进行150 bp测序。

1.9 数据统计分析

我们利用PCR ARRAY通过Real-Time PCR分析了参与葡萄糖代谢过程中84个关键基因的表达。PCR ARRAY中包含5种管家基因, 基因组DNA污染质控。未经修饰的ENO1的多肽EG-4作为对照, 采用相对定量法(2–∆∆Ct)分析了葡萄糖代谢通路中基因表达水平的变化, 通过T-Student计算P值。筛选出变化倍数在2以上, 具有统计学意义(P<0.05)的差异表达的基因。利用DAVID对PCR ARRAY葡萄糖代谢通路中差异表达的基因进行功能富集。

转录组数据分析, 参考基因组使用的是ENSEMBL,Danio rerio.GRCz11.100, 比对软件是Hisat2(v2.0.1)默认参数, 定量软件是Htseq(v0.6.1),KEGG使用的是R包里的数据库。基因差异分析使用Bioconductor软件包的DESeq2(V1.6.3)进行分析,对检测的结果按照差异显著性标准(差异基因表达变化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)进行筛选,统计基因显著性差异表达上下调情况。然后对数据进行相似度计算, 并根据相似度将数据进行分类,从而将具有相同功能或密切联系的基因聚集成类,识别未知基因的功能或已知基因的未知功能, 推断是否共同参与同一代谢过程或细胞通路。最后利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)R包里的数据库对差异基因进行通路(Pathway)显著性富集分析, 来确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

2.1 四种多肽对PAC2细胞增殖的影响

实验采用CCK-8评估PAC2细胞增殖和细胞活性。与对照组相比, 甲基化修饰的烯醇化酶肽(EGMe)表现为抑制PAC2细胞增殖; 乙酰化修饰的烯醇化酶肽(EG-Ac)表现为极显著地促进细胞增殖; 磷酸化修饰的多肽(EG-Ps)也表现为较为明显地促进细胞增殖; 然而没有经过任何修饰的多肽(EG)对细胞的作用并不明显(图1)。

图1 烯醇化酶1多肽修饰的处理PAC2细胞的计量分析Fig. 1 Quantitative analysis of PAC2 cells in different modified enolase peptidesP>0.05(用n表示); 0.010.05 (indicated by n); 0.01

2.2 四种多肽处理对胞内和胞外LDH释放的影响

胞内总LDH的含量一方面可以反映细胞糖酵解代谢生成乳酸的能力, 另一方面能间接反映细胞数量的多少。结果显示(图2): 与对照组相比, ENO1的4种多肽处理PAC2后的导致细胞内总LDH的含量均下降, 尤其未修饰肽最显著。

图2 24h时PAC2细胞总LDH的相对含量Fig. 2 Relative content of total LDH in pac2 cells at 24h

胞外LDH的释放被认为是细胞膜完整性的重要指标, 通过检测质膜破裂的细胞中释放到培养液中LDH的活性, 可实现对细胞膜完整性的定量分析[18]。结果显示4种多肽处理后细胞LDH的释放量极低,其中释放最多的EG-Ac处理PAC2细胞其LDH的释放率仅为胞内LDH的3.953871%, 因此, 修饰后ENO1的4种多肽没有或很少破坏细胞膜结构的完整性。

2.3 四种多肽处理对2-磷酸甘油酸(2-PG)的影响

2-PG是糖酵解途径的重要中间代谢产物, 在烯醇化酶(ENO1)的催化下转化为磷酸烯醇丙酮酸(PEP), 后者又被丙酮酸激酶转化为丙酮酸。本实验所用2-PG试剂盒是通过2-PG酶转化成PEP,PEP进一步转化成丙酮酸, 通过检测丙酮酸含量来间接反映2-PG含量。图 3显示4种多肽处理后的细胞生成丙酮酸的量都显著降低, 而修饰的EG下降更为明显。实验结果显示4种多肽处理后细胞内2-PG和丙酮酸含量下降, 4种多肽都不同程度地改变了糖酵解代谢途径或者改变内源性烯醇化酶反应活性, 特别是修饰EG比未修饰EG改变更为明显。

图3 多肽处理24hPAC2 细胞2-PG的相对含量Fig. 3 Relative content of 2-PG in peptide-treated PAC2 cells at 24h

2.4 四种多肽对线粒体和溶酶体的影响

线粒体和溶酶体结构观察比较显示对照组的细胞线粒体和溶酶体都呈现单层完整的细胞形态结构, 经过修饰后的4种多肽处理细胞后溶酶体均呈现不同程度的细胞粘附团(图4)。经过甲基化多肽EG-Me和乙酰化修饰的多肽EG-Ac使线粒体发生聚集, 经过磷酸化修饰的EG-Ps及未修饰的多肽EG处理后PAC2细胞中明显看到绿色荧光聚集变大变亮, 可见线粒体体积变大, 推测是线粒体发生了融合的结果。这些两种细胞器的形态改变也提示氧化磷酸化发生变化。

图4 四种多肽对PAC2细胞线粒体和溶酶体的影响Fig. 4 Fluorescence image of mitochondrion and lysosome staining of PAC2 cell after 4 peptide treatments嵌入图为细胞放大图。左上角标尺: 50 μmInsets show magnification of individual cells. Upper left scale bar: 50 μm

2.5 四种多肽对葡萄糖代谢通路的影响

利用PCR ARRAY分析参与葡萄糖代谢过程中84个关键基因的表达。结果显示甲基化修饰的EGMe引起13个基因的表达上调和3个基因的表达下调。乙酰化修饰的EG-Ac 组有6个基因的表达上调和4个基因的表达下调。经过磷酸化修饰的EGPs组有3个基因的表达上调和41个基因的表达下调(图5和表 1)。

图5 四种多肽对葡萄糖代谢通路中特异性基因表达的相对表达水平Fig. 5 Effects of four peptides on relative expression level of specific gene in glucose metabolic pathway

通过DAVID对PCR ARRAY葡萄糖代谢通路中差异表达的基因富集分析(表1)发现, 甲基化修饰EG-Me和乙酰化修饰EG-Ac处理后的PAC2细胞,表达上调的基因明显多于下调的基因。相反, 磷酸化修饰的EG-Ps处理后的PAC2细胞, 表达上调的基因明显多于下调的基因。这说明多肽共价修饰不同程度地改变细胞糖酵解、糖异生、葡萄糖代谢调控、磷酸戊糖途径、糖原合成和糖原分解、糖酵解、糖异生等代谢途径。

表1 糖代谢途径中差异表达基因的富集Tab. 1 Enrichment of differentially expressed genes in glucose metabolism pathway

2.6 基因差异表达和通路分析

为了将糖代谢与细胞增殖关联, 本文将空白对照处理和乙酰化修饰的EG-Ac处理的PAC2细胞进行转录组测序。按照差异显著性标准(差异基因表达变化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)进行筛选, 统计基因显著性差异表达上下调情况。如图 6所示, 与对照组相比, 有189个基因显著性上调,45个基因显著性上调。火山图表示样本采集有代表性, 差异分析非常明显。

图6 乙酰化修饰ENO1多肽处理引起PAC2差异表达基因火山图Fig. 6 Volcano map of differentially expressed genes induced by acetylation modified eno1 polypeptide in PAC2

将筛选出来的显著性差异基因从细胞组分(CC, cellular component)、生物进程(BP, biological process)和分子功能(MF, molecular function)三个层面进行GO功能显著性富集分析, 然后采用通过KEGG分析显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径(表2和表 3)。

表2 乙酰化修饰ENO1多肽处理引起PAC2差异表达基因KEGG富集分析(疾病相关的通路)Tab. 2 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (disease related pathways)

表3 乙酰化修饰ENO1多肽处理引起PAC2差异表达基因KEGG富集分析(代谢相关的通路)Tab. 3 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (metabolism related pathways)

由图 7可见, 可显著富集到30条途径, MF Term包括ATP结合、钙离子结合、结构分子调节、肌动活动、微管肌动活动、三价铁运动、NAD+ADP核苷转移酶活性、双链RNA腺苷脱氨酶活性和左手Z-DNA结合; CC Term包括细胞内、微管、肌球蛋白复合物、微管相关复合物、细胞内复合物、微管骨架和脂类粒子; BP Term包括微管为基础的运动、体节特异性、抗原处理和内源性肽通过MHC-1类抗原呈递、细胞铁离子稳态、ATP分解代谢过程、铁离子转运、有丝分裂纺锤体定位、ATP合成过程、电子传递、胆固醇流出、有丝分裂纺锤体组装检查。GO富集结果显示, 一些ATP结合和分解过程和NAD+ADP核苷转移酶活性都受到了影响, 说明乙酰化修饰烯醇化酶1多肽EGAc可以改变细胞的能量代谢过程。

图7 乙酰化修饰ENO1多肽(EG-Ac)处理引起PAC2差异表达基因GO富集分析Fig. 7 Enrichment analysis of pac2 differentially expressed gene go caused by acetylation modified eno1 polypeptide treatmentGO富集柱状图。纵坐标为富集的GO term, 横坐标为该term中差异基因个数。不同填充用来区分生物过程、细胞组分和分子功能Go enrichment histogram. The ordinate is the enriched GO term, and the abscissa is the number of differential genes in the term. Different filling are used to distinguish biological processes, cellular components and molecular functions

KEGG通路富集分析将富集到的一些DEGs关联到一些相关的信号通路。与对照组相比, 一些与癌症和病毒感染相关的信号通路比较明显。与疾病相关的信号通路有人乳头瘤病毒感染、甲型流感、单纯疱疹病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、病毒致癌、肥厚型心肌病(HCM)、丙型肝炎、小细胞肺癌、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、癌症中的转录失调、胰腺癌、microRNA与癌症、结直肠癌、癌症中的蛋白多糖等信号通路。与代谢相关的信号通路有苯丙氨酸和酪氨酸等多种氨基酸代谢、胆固醇代谢、糖代谢和蛋白质代谢等信号通路。所富集的多个代谢通路与PCR array结果相符。还富集到一些其他的信号通路, 有胞浆DNA感应途径、卵母细胞减数分裂、孕酮介导的卵母细胞成熟、黏着、RIG-Ⅰ样受体信号通路、ECM受体相互作用、雌激素信号通路等信号通路。

3.1 烯醇化酶1不同修饰多肽改变PAC2细胞生长模式

本文从亚细胞水平和细胞代谢水平相互验证了4种多肽ENO1对PAC2细胞生长和代谢的影响。首先通过CCK-8细胞活性检测, 可以反映4种多肽处理细胞后细胞活性和增殖能力, 接着通过胞内外LDH释放实验检测糖酵解代谢和细胞膜完整性, 再用线粒体(绿色)和溶酶体(红色)专一性染料对4种多肽处理的细胞进行染色, 检测细胞器形态和代谢功能, 然后通过2-PG和PCR Array实验检测糖代谢相关途径, 最后利用RNA测序进行转录组深层功能分析。

线粒体和溶酶体对维持细胞内稳态起到重要的作用, 在很多疾病中都观察到他们的功能缺陷。线粒体是真核细胞重要的细胞器, 是细胞氧化磷酸化和ATP合成的主要场所, 线粒体与众多疾病的发生、发展、治疗密切相关[19]。线粒体是一个高度动态、呈网络结构的细胞器, 他们通过不断分裂和融合来调节自身动态, 交换线粒体内部分子。损伤线粒体可通过与健康线粒体相互融合交换成分, 在一定程度上修复缺陷, 改善功能[20]。因此线粒体的融合和分裂对线粒体形态功能都有很大的调节作用[21]。溶酶体不仅是细胞中物质的降解中心, 也是一些物质代谢过程和细胞生长的重要代谢传感器[22]。在线粒体自噬和线粒体应激过程中, 线粒体和溶酶体融合来维持线粒体和细胞的稳态; 通过形成线粒体-溶酶体的膜接触点来维持两者的动态平衡[23]。线粒体和溶酶体通过RAB7 GTP酶作用相互交流,对细胞功能的完整性有重要作用[17]。结合CCK-8结果和线粒体形态的变化表明4种ENO1多肽影响细胞的生长和代谢状况, 但只有乙酰化修饰ENO1肽EG-Ac促进细胞增殖效果最为明显。虽然磷酸化修饰多肽EG-Ps和未修饰多肽EG处理后的细胞对照组相比线粒体发生了一定程度的融合, 但都没有增加细胞膜通透性, 应该是改变细胞代谢的结果。

3.2 烯醇化酶1不同修饰多肽改变PAC2细胞糖代谢模式

LDH发挥作用是Warburg 效应的重要一环, 与恶性肿瘤的增殖和侵袭息息相关[3]。但LDH的具体调节通路不清楚。本实验结果显示4种多肽处理后细胞内总LDH的含量均显著降低。检测胞外LDH释放的活性实验结果表明4种多肽处理后没有或很少程度的造成细胞膜结构的破坏, 总LDH含量的检测结果表明4种多肽处理后均显著下降, 表明4种多肽处理后细胞生成乳酸的能力下降。进一步的2-磷酸甘油酸检测发现4种多肽处理后2-PG含量显著降低, 结合LDH检测结果, 表明4种多肽可能抑制内源性烯醇化酶反应活性的能力, 特别是共价修饰后抑制ENO活性。

进一步利用PCR ARRAY筛选出差异表达的基因进一步分析了修饰化多肽对糖代谢通路的影响。与对照组相比, 磷酸化修饰多肽EG-Ps处理后细胞相关糖代谢通路基因整体上呈现下调趋势, 表明磷酸化修饰多肽EG-Ps整体上是抑制细胞的糖代谢通路。甲基化修饰多肽EG-Me和乙酰化修饰多肽EG-Ac对细胞糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径、三羧酸循环等糖代谢通路都表现出不同程度的调控作用, 但没有磷酸化修饰作用明显。

3.3 乙酰化修饰烯醇化酶1多肽改变细胞能量和物质代谢模式

PCR ARRAY结果提示乙酰化修饰多肽EGAc可以改变细胞的糖代谢模式, 但可能不是促进细胞增殖的主要原因。进一步的转录组结果显示,GO富集到些ATP结合和分解过程和NAD+ADP核苷转移酶活性都受到了影响, 说明PAC2细胞内能量代谢发生了变化, 我们推测乙酰化修饰烯醇化酶1多肽EG-Ac可以改变PAC2细胞的能量代谢过程。

转录组结合PCR Array检测结果显示, 调节磷酸戊糖途径中的rbks基因表达上调, rbks基因编码的蛋白是激酶PfkB家族的一个成员。编码的蛋白质在ATP和Mg2+存在下磷酸化核糖形成核糖-5-磷酸, 参与调控磷酸戊糖途径。rbks基因表达上调表明乙酰化修饰多肽可能激发磷酸戊糖途径来增加细胞的核酸代谢。转录组结果还显示乙酰化修饰多肽处理后参与氨基酸代谢和脂类代谢基因明显富集。我们推测这些代谢可能是乙酰化修饰多肽处理后刺激细胞增殖的代谢机制。

烯醇化酶(ENO1)是糖酵解途径的一个重要蛋白酶, 同时也是一个多功能蛋白。本文研究显示同一个烯醇化酶蛋白肽经不同修饰处理后, 对细胞生长、代谢途径, 对细胞线粒体和溶酶体形态结构的完整性都有特异影响。在细胞水平上, 甲基化修饰多肽表现为抑制细胞增殖、乙酰化和磷酸化修饰表现为促进细胞增殖。EG-Ps总体上抑制糖代谢,而EG-Ac促进氨基酸代谢, 脂类代谢和磷酸戊糖途径促进细胞生长, 并调控一些疾病如一些癌症和病毒感染等的发生发展过程。不同修饰的ENO1多肽发挥作用的具体分子机制和所调节的代谢通路尚未明确, 有待于进一步研究。本文采用的研究方法对以后ENO1蛋白以及多肽的多功能研究提供了一个新的思路, 也有助于生物活性多肽功能和营养学的研究。

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