赵洋洋，高吊清，刘 菲，武 鑫，贾旭林

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一种以心脏炎症为特征的心血管疾病，多见于儿童和青少年，柯萨奇病毒B3(Coxsachie virus B3，CVB3)是最常见的病原体，其可导致心肌坏死，诱导心力衰竭和扩张性心肌病，严重者可危及生命[1]。近年来研究发现，在CVB3感染心肌细胞的过程中发现了两种程序性死亡方式，一种是依赖于半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和p53活化的细胞程序性死亡方式即细胞凋亡，另外一种是依赖 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介导的一种程序性细胞死亡即细胞焦亡，细胞焦亡是高度炎症性的程序性细胞死亡方式，其形态具有坏死和凋亡的特征[2-3]。已有研究发现，细胞焦亡在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)诱导的病毒性心肌炎细胞模型中被激活，参与其病理过程[4]。细胞焦亡在许多炎症性疾病的发生发展中起着至关重要的作用，但其在CVB3所致的病毒性心肌炎发病机制中的作用尚不明确。本研究采用CVB3感染构建病毒性心肌炎小鼠模型，探讨CVB3可否通过诱导小鼠心肌细胞焦亡促进心肌炎的进展。

1.1 细胞与毒株 Hep2 细胞购于中乔新舟生物科技有限公司。CVB3 Nancy 株购于 ATCC。

1.2 动物 6周龄Bal b/c雄性小鼠30只(山西医科大学实验动物中心提供)，体质量16～20 g。

1.3 实验材料 兔抗小鼠Caspase-1、半胱天冬氨酸蛋白酶原(pro-Caspase-1)单克隆抗体购于Abcam；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)均购于Bioworld；
总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、扩增试剂盒均购于TaKaRa公司；
Caspase-1、NLRP3购自华大基因(NLRP3正向引物：5′-CGAGACCTCTGGGAAAAAGCT-3′，反向引物：5′-GCATACCATAGAGGAATGTGATGTAC-3′；
Caspase-1正向引物：5′-TGGTCTTGTGACTTGGAGGAC-3′，反向引物：5′-GGTCACCCCTATCAGCAGTGG-3′；
GAPDH正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；
反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′)。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购于江莱生物。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 将30只小鼠分为对照组(10只)和实验组(20只)，对照组腹腔注射0.1 mL无菌生理盐水，实验组每只小鼠腹腔注射0.1 mL含105半数组织培养感染剂量(TCID50)CVB3病毒液，分别于感染后的第3天、第7天随机选取10只小鼠处死，收集小鼠全血及心脏组织。

1.4.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测NLRP3炎性小体及 Caspase-1 mRNA表达水平 取各组不同时间点心脏组织，按照说明书提取心肌组织中总RNA，测定总RNA浓度及纯度，进行逆转录和扩增。以 GAPDH 为内参，计算各组目的基因的2-△△CT值。

1.4.3 蛋白质印迹法(Western Blot)检测Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白水平 取各组小鼠心脏组织，超声粉碎组织，冰上裂解提取蛋白， 10 000×g离心10 min，取上清测定蛋白含量并配平。配胶上样后经电泳转膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，对应抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育，TBST洗膜3次。利用凝胶成像系统曝光，使用Image J软件对图像进行灰度分析。

1.4.4 白细胞介素-1β(IL-1β)水平的检测 取对照组与实验组于感染后第3天、第7天小鼠，摘除眼球取血，将全血在室温下放置1 h，待全血自然凝固并析出血清后，4 ℃环境下，1 000×g 离心20 min，收集血清。按照 ELISA 检测试剂盒中说明书的步骤检测小鼠血清 IL-1β含量。

2.1 两组心肌组织NLRP3炎性小体及 Caspase-1 mRNA表达比较 RT-qPCR结果显示，实验组第3天、第7天处死小鼠的心肌组织中NLRP3炎性小体及Caspase-1 mRNA表达较对照组明显增加(P<0.05)。详见图1。

2.2 两组心肌组织pro-Caspase-1及 Caspase-1蛋白水平比较 实验组第3天、第7天处死小鼠的心肌组织pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。详见图2～图4。

与对照组比较，＊ P<0.05。图1两组心肌组织NLRP3炎性小体及Caspase-1 mRNA表达比较

图2 两组心肌组织pro-Caspase-1及Caspase-1蛋白表达条带图

与对照组比较，＊ P<0.05。图3两组心肌组织pro-Caspase-1蛋白表达水平比较

与对照组比较，＊ P<0.05。图4两组心肌组织 Caspase-1蛋白表达水平比较

2.3 两组小鼠血清IL-1β水平比较 实验组第3天、第7天血清IL-1β水平较对照组明显增加(P<0.05)。详见表1。

表1 两组小鼠血清IL-1β水平比较(±s) 单位：ng/L

近年来的研究发现，病毒性心肌炎的发病率和死亡率仍居高不下。CVB3感染是病毒性心肌炎的主要原因，可导致青壮年猝死或进展为扩张型心肌病。病毒性心肌炎的主要特征是局部和全身的炎症反应。虽然炎症过程最终是病毒消除和愈合的必要免疫防御，但炎症是造成心肌损伤的主要机制[5]。

细胞焦亡是细胞发生的一种依赖Caspase、炎症小体介导的程序性死亡，其特征是gasdermin D(GSDMD)介导的膜孔形成、细胞肿胀和快速裂解，随后大量释放促炎介质IL-1β、白细胞介素-18(IL-18)[6-7]。细胞焦亡不仅会引起局部炎症，还会导致炎症反应的放大。细胞焦亡主要有两种途径：Caspase-1介导的典型途径和Caspase-4/Caspase-5/Caspase-11介导的非典型途径[8]。其中细胞焦亡的经典途径是由炎性小体激活来介导完成的。炎性小体的基本结构包括胞浆内模式识别受体(PRRs)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC) 和 pro-Caspase-1(CASP1)3部分[9-10]。NLRP3是目前研究较为深入的炎性小体，可被病毒、细菌、真菌的 DNA 或 RNA、紫外线等外源性危险信号分子以及三磷酸腺苷(ATP)、晶体等内源性危险信号分子所激活[11-13]。NLRP3炎性小体被激活后，产生具有活性的Caspase-1，Caspase-1作用于细胞焦亡的执行蛋白GSDMD，从而产生GSDMD-N末端的活化形式；
GSDMD-N端与细胞膜和细胞内细胞器膜上的脂质组分结合导致GSDMD-N低聚化。在质膜上形成非选择性孔，使游离的细胞外水分进入细胞内，细胞迅速膨胀和破裂，推动细胞焦亡和释放细胞内容物，导致炎症反应[14]，同时GSDMD是炎症介质IL-1β、IL-18分泌和成熟所必需的介质[15]，进一步扩大炎症反应。目前公认的炎症和细胞死亡在病毒性心肌炎、动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭中起重要作用[16]。越来越多的研究证实细胞焦亡与心血管疾病有关。

既往已有研究发现，NLRP3在CVB3所致心肌炎的发生发展中发挥重要作用，NLRP3及IL-1β mRNA的表达水平在CVB3感染的小鼠心脏中明显升高[17]。病毒性心肌炎病人外周血NLRP3炎性小体及Caspase-1 mRNA表达水平升高[18]。

本研究采用CVB3感染构建病毒性心肌炎小鼠模型，通过对发生细胞焦亡的过程中必要的信号分子进行检测，发现实验组第3天、第7天处死小鼠的心肌组织中NLRP3炎性小体及Caspase-1 mRNA表达较对照组明显增加；
心肌组织pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达水平较对照组明显增加；
血清IL-1β表达较对照组明显增加。NLRP3炎症小体由 NLRP3、ASC 和 pro-Caspase-1 组成[4]。实验组心肌组织中NLRP3炎性小体mRAN及pro-Caspase-1的蛋白表达水平明显增加，提示细胞焦亡已被激活。Caspase-1作为细胞焦亡的主要介导者，通过对其在实验组心肌组织中的mRNA及蛋白表达明显升高，可以证明Caspase-1已被活化，同时活化后的Caspase-1可加工分泌促炎细胞因子IL-1β，从而放大局部炎症反应，本研究中实验组小鼠血清IL-1β明显升高，进一步提示 NLRP3 炎症小体-Caspase-1-IL-1β通路在CVB3诱导的病毒性心肌炎病理生理过程中被激活，从而表明CVB3可通过诱导心肌发生细胞焦亡促进心肌炎症反应的进展。

综上所述，通过对CVB3病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡的实验研究发现，CVB3可以通过诱导心肌细胞焦亡，从而促进心肌炎的进展。为临床上诊断及寻找拮抗心肌细胞焦亡的药物来减轻心肌炎症反应，预防心肌纤维化提供了新的思路及策略。

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