胡彦江，夏淑春，鄢洪海，金静，张茹琴

(1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109；
2.青岛农业大学植物医学学院/山东省植物病虫害综合防控重点实验室)

烟草(NicotianatobacumL.)是重要的经济及药用作物[1]，2020年我国烟草行业实现工商税利总额12 803亿元，在国民税收中占较大的比例，为国家和地方财政增收、经济发展做出了积极贡献[2]。我国烟草种植面积和产量居世界首位，每年需要大量的烟苗用于移栽[3]。育苗是烟草生产的重要环节，培育生长整齐、健壮无病的烟苗是实现烟叶优质、适产、高效、低成本生产的基础[4-6]。目前，生产上主要采用漂浮育苗技术培育烟苗[4]，但因整个育苗过程在温室中进行，空气温湿度较大，基质中养分和水分充足，烟叶生长过快，导致烟苗柔嫩、抗逆性差，且因地上部分生长较快，影响了根系的发育，因此必须通过一定的控苗技术达到壮苗的目的。目前生产上主要采用剪叶和化控技术来控制烟苗的旺长，前者在烟草漂浮育苗过程中一般进行3～5次，增加了劳动强度、用工成本及花叶病毒病的传播概率，后者易对环境及烟草产品造成污染[5-6]。

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)真菌是土壤中的一种有益微生物，80%以上的陆生植物能与其形成共生体[7]。在菌根共生体中，寄主植物为AM真菌提供光合产物，而AM真菌从土壤中吸取水分和矿质营养输送给其寄主植物，促进植物的生长、改善土壤营养状况、调节植物激素、改变植物根系形态，从而提高植物的产量、质量和抗逆性[8]，但偶尔也有菌根对寄主植物的生长无影响甚至抑制生长的报道[8-9]。烟草由于能与AM真菌形成良好的共生关系，是研究较多的模式作物之一[10-11]。目前从烟草根系土壤分离报道的AM真菌已达13属54种，表明烟草栽培的潜在AM真菌资源较为丰富[11]。AM真菌对烟草育苗、生长发育、养分吸收、抗胁迫能力以及抗病虫害能力等研究报道较多[1-3,10-13]。利用漂浮育苗技术在烟草播种时接种AM真菌，有助于培育壮苗，菌根烟苗移栽后，可较早地发挥菌根效应，促进烟苗根系的生长发育和形态建成，并缩短缓苗期，为生产高产优质烤烟奠定了基础[13]。

作者在试验中发现，烟草播种时接种AM真菌，菌根烟苗株高、叶面积等均小于非菌根烟苗。基于上述研究背景，提出了一个假设：在烟草播种时接种AM真菌，是否可利用菌根共生关系建立早期AM真菌消耗烟草营养达到控苗的目的。因此，本试验以烤烟‘K326’为供试品种，以12株AM真菌为供试菌种，在穴盘播种时接种AM真菌，研究菌根对不同生长期烟草生长的影响，以期筛选出能控苗的AM菌种，达到利用生物技术调节烟草生长的目的，这对于实现烟叶生产可持续性发展具有重要的意义。

1.1 试验材料

1.1.1 供试烟草品种

选用生产上主栽烤烟品种‘K326’包衣种，种子由中国烟草总公司云南省烟草公司玉溪市公司提供。

1.1.2 供试AM真菌及其菌剂制作

供试的12株AM真菌，包括1株幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)(编号AM1)，11株摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)(编号分别为AM2、AM3、AM4、AM5、AM6、AM7、AM8、AM9、AM10、AM11和AM12，简写为AM2至AM12，下同)，其中菌株AM12购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所，其他菌株由同行赠送，均保藏于青岛农业大学植物病生理学研究室。

接种前先将12株AM真菌进行扩繁培养。扩繁培养基质为园土和河沙(体积比1∶1)，121 ℃ 0.1 MPa蒸汽灭菌2 h，放置约7 d后混匀装入花盆(23 cm×20 cm×16 cm)，每盆先装入2 000 g扩繁基质，然后接种50 g AM菌剂，其上撒白三叶草(TrifoliumrepensL.)种子，上覆约1 cm厚灭菌河沙，每周浇1次霍格兰(Hoagland)营养液，其他均常规管理。播种后4个月时，用土壤钻随机挖取三叶草根系，剪成1 cm长的根段，染色后检查菌根形成情况[14]。待形成泡囊、丛枝及孢子等结构时，剪去三叶草地上部，将基质、剪碎的根系混合均匀作为菌剂，装入布袋保存在阴凉干燥的地方，待接种烟草用。

1.1.3 培养基质

河沙、草炭土、园土按体积比1∶1∶1混合，高温高压(121 ℃)灭菌2 h后用作烟草培养基质。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

在烟草培养基质中分别接种12个AM菌剂，另设不接种AM菌剂的处理为非菌根对照(CK)，共13个处理(CK、AM1至AM12)；
采用50(5×10)穴盘育苗，每处理25穴(出苗后定植为每穴1株)；
随机排列，重复3次。

参考刘润进等[14]的培养基质接种法，先在质量分数10%次氯酸钠消毒的育苗盘穴中装入等量的灭菌培养基质，在其上加入50 g AM菌剂，然后每穴均匀地撒上5粒烟草种子，再在上面撒上1 cm厚的培养基质覆盖种子。浇透水后放置在温室内培养，不同处理随机放置。待出苗后定植至每穴1株烟苗。育苗期间，每周浇一次Hoagland营养液，每3 d左右浇一次水，其他常规管理。

1.2.2 烟草根系AM真菌侵染率测定

烟草播种后90 d，随机挖取烟草根样，流水冲洗掉根上的基质颗粒后，将根剪成1 cm长的根段进行染色。用镊子和挑针将粗细一致的根段整齐地排列在载玻片上，每个载玻片排列25条根段，载玻片加盖玻片[14]。在Leica DM750数码显微镜(徕卡，德国)下观察根外菌丝及孢子形成情况，然后轻敲盖玻片压裂根组织以便观察根内丛枝、泡囊及菌丝等结构的形成情况并拍照。每处理观察50个根段。AM真菌侵染率为真菌侵染根段数占调查总根段数的百分率[15]。

1.2.3 烟苗生长指标的测定

分别于接种后10 d、20 d、30 d、40 d、60 d、90 d，用软尺测量烟草茎基部到茎尖生长点的长度作为株高。参考秦丽娟[16]的方法，模拟株高拟合曲线y，以下式计算株高生长率变化率y″，

接种后90 d，用游标卡尺测量烟草地径。剪取地上部，置于80 ℃烘箱烘至恒重，用电子天平称其干重作为生物量。

1.2.4 烟苗叶绿素含量测定

叶绿素含量用紫外分光光度法测定[17]。接种后90 d，取烟草从上往下数第四叶，用自来水冲洗叶表面浮尘，去掉中脉，将其剪碎后混匀。称取剪碎的新鲜样品0.2 g放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2.5 mL 体积分数95%乙醇，研成匀浆后再加入10 mL 95%乙醇，继续研磨至组织变白。静置3 min后，取1张滤纸置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，过滤到25 mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣3次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25 mL，摇匀。将提取液倒入光径1 cm的比色杯内。以95%乙醇为空白对照，在波长665 nm、649 nm下测定吸光值A665、A649。根据吸光值用下式计算叶绿素a、b的提取浓度：

Ca=13.95A665-6.88A649；

Cb=24.96A649-7.32A665；

Ct=Ca+Cb；

叶绿素含量(mg/g)=Ct×V×N/W

其中，V表示提取液体积(L)，N表示稀释倍数，W表示样品鲜重(g)。

1.3 数据分析

用SPSS 20.0数据分析软件对数据进行差异显著性及相关性分析。

2.1 烟草菌根侵染率测定

烟草‘K326’播种后90 d测定菌根侵染率，发现12个AM菌剂接种的烟草根系均被侵染(图1)，形成典型的泡囊、丛枝、外延菌丝及孢子等结构，菌根侵染率为100%。但在未接种AM菌剂的对照(CK)烟苗根系中未观测到AM真菌结构。结果表明这12株AM真菌均能侵染‘K326’烟苗根系。

图1 部分AM真菌侵染烟草‘K326’根系状况Fig.1 Parts of AM fungi colonization of tobacco‘K326’roots

2.2 AM真菌对烟苗生长的影响

与对照相比，12个AM菌剂接种对烟苗株高均有显著的影响(图2，表1)。接种后30 d，所有菌根苗株高均小于对照(图2A)；
而接种后90 d，不同处理间株高有极显著的差异(P<0.01)(图2B)，其中AM3、AM4、AM6至AM10和AM12菌根烟苗株高均大于对照(表1)，烟苗生长速率变化率y″均大于0，分别为0.50、0.12、0.08、0.34、0.87、0.23、0.79和0.36，尤以AM3、AM7、AM8、AM10和AM12菌根烟苗y″增加显著。而AM1、AM2、AM5、AM11与对照烟苗y″均小于0，分别为-0.12、-0.40、-0.15、-0.08与-0.01。上述结果表明，12株AM真菌侵染早期均能矮化烟苗，但在生长后期，AM3、AM4、AM6至AM10和AM12反而促进烟苗株高生长，促生效果从大到小依此为AM8>AM10>AM3>AM12>AM7>AM9>AM4>AM6。

A.AM真菌接种后30 d；
B.AM真菌接种后90 d图2 AM真菌对不同生长期烟草‘K326’株高的影响Fig.2 Effect of AM fungi on the plant height of tobacco ‘K326’ at different stages of growth

接种后90 d，不同菌根烟苗间地径有极显著的差异(P<0.01)(表1)，除AM6和AM11菌根烟苗外，AM1至AM5、AM7至AM10和AM12地径均极显著大于对照。表明AM1至AM5、AM7至AM10和AM12真菌侵染均极显著地促进‘K326’烟苗地径的生长，AM8促进效果极显著大于AM2至AM5、AM9、AM10和AM12，但与AM1和AM7间无极显著差异(P≥0.01)。

接种后90 d，不同AM菌剂接种对‘K326’烟苗生物量也有极显著影响(P<0.01)(表1)，其中AM1、AM3、AM7和AM8菌根烟苗生物量均极显著大于对照，而其他菌根烟苗生物量与对照无极显著的差异(P≥0.01)。表明AM1、AM3、AM7和AM8菌剂接种均能极显著地增加‘K326’烟苗的生物量，但这四个处理间无极显著差异。

2.3 AM真菌对烟苗叶片叶绿素含量的影响

接种后90 d，不同菌根烟草间叶绿素含量有极显著的差异(P<0.01)(表1)，其中AM1、AM2、AM4、AM5和AM7叶绿素含量均极显著大于对照，而其他处理与对照无显著差异(P<0.01)。表明菌根AM1、AM2、AM4、AM5和AM7均极显著地提高了‘K326’烟苗叶绿素的含量，但这五个处理间无极显著差异(P≥0.01)。

表1 AM真菌对烟草‘K326’生长及叶绿素含量的影响Table 1 Effects of AM fungi on the growth and the chlorophyll content of tobacco ‘K326’

2.4 Pearson相关性分析

不同AM烟草生物量与株高间、叶绿素含量与株高间、叶绿素含量与地径间均无显著相关性(P>0.05)(表2)，而烟草生物量与地径间、生物量与叶绿素含量间有显著相关性(P<0.05)，相关系数分别为0.757 7、0.587 2。这表明菌根烟草生物量、地径的增加与叶绿素含量呈显著正相关。

表2 株高、地径、生物量及叶绿素含量间的相关性Table 2 Correlation between plant height,ground diameter,biomass and chlorophyll content

植物播种期接种AM真菌具有矮化苗木的作用，原因是AM真菌从与寄主根系识别、侵染、形成菌根、再到发挥菌根效应需要一定的时间[13,18-19]。一般而言，从接种到大量出现根外菌丝至少需要35～45 d[13]。在此之前，AM真菌基本处于寄生状态，不仅不发挥菌根效应，而且还要消耗寄主4%～20%的光合产物，用于菌丝生长发育[8-9,13]。本试验中，在烟草‘K326’接种后30 d，发现12个供试AM菌剂接种均有矮化烟苗的作用，其结果与前人的报道基本一致[9,13]。接种后90 d，与对照相比，AM3、AM4、AM6至AM10和AM12均极显著地促进了烟草株高生长，其效果从大到小依次为AM8>AM10>AM3>AM12>AM7>AM9>AM4>AM6；
除AM6和AM11外，其他10个AM菌剂均极显著地促进了烟苗地径的生长，其中AM8促进效果极显著大于AM2至AM5、AM9、AM10和AM12，但与AM1和AM7无极显著差异；
AM1、AM3、AM7和AM8菌根烟草生物量均极显著地增加，但这四者间无极显著差异；
AM1、AM2、AM4、AM5和AM7菌根烟叶叶绿素含量极显著地增加，而这五者间无极显著差异。Pearson相关性分析表明，‘K326’生物量与地径间、生物量与叶绿素含量间呈显著正相关。因此，分析烟草生长后期生物量增加的主要原因是接种AM菌剂提高了烟叶叶绿素含量，从而导致地径增加。

大量研究表明，接种AM真菌可促进烟草光合作用从而促进其生长[13,18-21]，增加其矿质营养含量和抗氧化能力[22]，甚至在严重干旱胁迫下，还可促进烟草的生长、提高其精油、次生代谢产物及产量[1]。在中烟100或秦烟96上施用100 kg/hm2摩西斗管囊霉或根内根孢囊霉菌剂，促进了烟草的生长发育，提高了烟叶的产量、产值，改善了烟叶内在化学成分的协调性[19]。菌根还可有效地促进烤烟根系形态的发育，优化根系结构，进而促进烟株对养分的吸收和积累，干物质累积量、株高、最大根长、根表面积、根体积、总根长、根尖数及养分吸收量均得到不同程度提高[13,19]。在生产研究中，应用不同的技术来培育烟草壮苗[3-6,13]，但尚未见有利用AM真菌控苗的研究报道。

在本次试验中，烤烟‘K326’播种时接种AM1、AM3、AM7和AM8，在生长早期均能矮化烟苗，达到控旺的目标，在生长后期通过提高烟草叶绿素含量和地径生长，从而提高其生物量，达到调节烟草生长的目的。这种生物控苗技术具有潜在的生产应用价值，在大规模漂浮育苗以及移栽后大田培育过程中，接种适宜的AM真菌是培育壮苗、提高肥料利用的一种经济有效的方法。

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