姜安静， 董乙强,2,3*， 阿斯太肯·居力海提， 周时杰， 聂婷婷， 李彩英， 席 伟， 安沙舟,2,3

(1.新疆农业大学草业学院， 新疆 乌鲁木齐 830052；

2.新疆草地资源与生态重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830052；

3.西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830052)

新疆草地具有分布面积广、资源丰富等特点，同时在涵养水源、防风固沙和保护生物多样性等方面均扮演着重要角色，更影响着地方畜牧业的发展。近年来，由于频繁的人为干扰和恶劣的气候条件，新疆部分草地呈不同程度的退化状态[1]。草地退化不仅影响当地社会的发展，且对当地以及周边地区生态安全也造成一定程度的威胁，退化草地生态系统的改良与恢复已成为亟待解决的问题之一。

封育是恢复退化草原的有效途径之一，也因其投资少、见效快，在世界各国被广泛应用[2]。目前关于封育对草地植物特征[3]、土壤特性[4]和微生物多样性[5]等方面已经做了大量的研究。研究表明封育可以提高植物的生物量，改善土壤理化性质，同时还可以通过改变养分的利用效率来改变土壤微生物群落结构和多样性[6]。土壤微生物群落是草地生态系统的关键驱动力，也是土壤物质循环的主要调节因子[7]，其群落结构以及多样性对环境变化具有高度敏感性[8]。因此，加强关于土壤微生物群落特征的研究可以有效了解封育效果，对草地恢复具有重要意义。其中，土壤微生物总量的90%是由细菌和真菌组成，土壤细菌更是作为全球最为丰富的菌种资源在生物地球化学循环过程中扮演重要角色，不仅对植物生长和生物产量产生重要影响，还在土壤碳循环等过程中发挥关键作用[9]。然而，目前关于封育对土壤细菌群落特征影响的研究结果仍然存在较大的争议。如有研究表明高寒草地封育4 a后降低了厚壁菌门相对丰度，提高了变形菌门和酸杆菌门的相对丰度，并提高细菌Chao 1指数[10]；
同时，也有研究表明，围栏封育11 a后高寒草甸草地土壤中变形菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门相对丰度升高，而酸杆菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰富度降低，细菌α多样性变化不显著，细菌群落受土壤全氮和速效磷影响较大[11]；
但有研究表明，封育4～7 a增加了荒漠草地酸杆菌门相对丰度，降低了变形菌门的相对丰度，且土壤容重和全磷含量是影响细菌群落的主要因素[12]。造成这种差异的原因与草地类型、封育年限、气候不同等具有较大的关系。关于不同草地类型土壤细菌群落特征对封育的响应亟需进一步深入系统研究。

基于以上认识，本研究依托新疆天山北坡西段山地草甸草地和温性草原草地国家级固定监测点，通过对封育区和放牧区土壤细菌群落特征的测定分析，阐明封育对土壤细菌群落结构和多样性的影响，揭示不同草地类型土壤细菌群落特征对封育的响应差异，并结合植物和土壤理化性质，探讨不同草地类型细菌群落特征的影响因素，以期为草地合理利用和退化草地恢复改良提供理论依据。

1.1 研究区概况

研究区分别位于新疆博尔塔拉蒙古自治州博乐市(山地草甸草地)和温泉县(温性草原草地)的国家级固定监测点，博乐市国家级固定监测点年均气温1.1℃，年均降水量400 mm，春季气温冷暖多变，夏季高温，气候炎热，伴有干热风，秋季气爽，主要优势种有天山羽衣草(Alchemillatianschanica)和禾草、杂类草等。温泉县国家级固定监测点年均气温3.6℃，年均降水210 mm，春秋季节特点不明显，夏季不炎热，秋季降温迅速，主要优势种有针茅(Stipacapillata)、冷蒿(Artemisiafrigida)、博洛塔绢蒿(Seriphidiumborotalense)、羊茅(Festucaovina)等。研究区的具体位置及基本状况见表1。

表1 研究区的地理位置及其基本情况Table 1 Description of the study sites

1.2 试验设计

在山地草甸(Mountain meadow，MM)草地和温性草原(Temperate steppe，TS)草地分别设置两个处理，即封育区(Grazing exclusion plots，GE)和自由放牧区(Freely grazing plots，FG)。封育区均从2012年设置围栏，于2021年取样已封育10 a，围栏封育前属于轻度退化草地，围栏封育区面积均为3.33×104m2，且围栏封育前后状态在植物组成、群落特征及地形地貌上基本相似。研究区2021年植物群落特征和土壤理化性质状况如表2和表3所列。

表2 植物群落特征状况Table 2 Characteristics of vegetation community

表3 土壤理化性质状况Table 3 Physical and chemical properties of soil

1.3 野外取样

1.3.1草地群落特征调查方法 2021年7月进行野外植物和土壤样品的采集，在封育区和自由放牧区分别布置3条样带，样带间的间距50 m，于每条样带上分别设置3个1 m×1 m的样方，样方间距在50 m左右，样方数量共计36个样方(2个试验样地×2个处理/试验样地×3条样带/处理×3个样方/样带)。首先记录各样方中的物种种类，并分种进行盖度、高度、密度及生物量的测定。其中，物种盖度(%)采用针刺法测定；
高度(cm)采用常规方法测量自然高度；
密度(株·m-2)为直接计数法记录株丛数；
生物量(g·m-2)采用齐地刈割法，并带回实验室置于烘箱105℃下杀青30 min后80℃烘干24 h至恒重后称重。

1.3.2土壤取样与测定方法 土壤样品采用土钻法，在测完草地群落特征的样方内，用土钻按土层深度0～5 cm，5～10 cm分层取样，并将每条样线分别均匀混匀后放入做好标签的密封袋中，带回实验室。将其中一部分置于4℃冰箱冷藏保存，剩余部分在室内捡出植物根系、石砾等杂物后自然风干，并将土样磨碎、混匀，然后分别过1 mm，0.25 mm筛贮存以备土壤样品的室内分析。土壤pH值使用pH计法；
土壤电导率采用电导仪测定(水土比为5∶1)；
土壤含水量采用105℃，24 h烘干称重法；
土壤容重采用环刀法。土壤有机碳采用重铬酸钾外加热法。

1.3.3土壤微生物采集及分析方法 在测完草地群落特征的样方内，按0～5 cm，5～10 cm土层采集土壤微生物样品，每条样线分别均匀混合后装入密封袋中置于车载冰箱(-20℃)中带回实验室。土壤微生物群落结构和多样性研究步骤为：(1)采用NanoDrop微量分光光度计测定核酸OD值，采用琼脂糖凝胶电检测DNA提取质量，采用Qubit荧光定量检测每一个样品的DNA浓度，而后计算样品DNA总量；
(2)以细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有barcode序列的338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)-806R(5′-GGA CTACHVGGGTWTCTA AT-3′)为引物，进行PCR扩增，获取PCR产物。通过热循环条件进行PCR扩增：98℃预变性2 min，98℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃终延伸5 min。将PCR扩增产物进行荧光定量；
(3)PCR产物经过定量及文库构建后，利用Illumina MiSeq PE 300平台进行高通量测序，获取细菌可变区碱基序列信息；
(4)利用QIIME2.0软件包，对测序片段进行OTU(分类学操作单元)聚类，OTU代表序列与Silva数据库进行比对分析，获取OTU对应的分类单元(包括门纲目科属种)及其相应的丰度信息；
(5)计算Chao 1，Shannon-Wiener和Simpson等度量指数；
(6)综合应用ANOVA方差分析等方法寻找各组样品中的特征菌，为深入挖掘菌群的功能、剖析作用机制做铺垫。本研究的微生物测序分析均在深圳微科盟科技集团有限公司生科云平台完成。

1.4 数据分析

采用Excel 2019对数据进行预处理，使用SPSS 25软件独立样本T检验对同种草地类型同一土层不同处理的细菌群落结构和多样性进行显著性分析，同时也对同种草地类型不同土层和不同处理间的细菌多样性进行显著性分析，利用SPSS 25软件齐性检验，再用Origin 2021进行绘图。数据用“均值±标准误”的形式表示。

2.1 封育对不同草地类型土壤细菌群落组成的影响

在山地草甸草地对不同土层细菌门水平相对丰度分析表明(图1)。0～10 cm土层中，有9个主要菌门，其相对丰度在封育前后均超过1%，为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和泉古菌门(Crenarchaeota)，其相对丰度合计占总体97.64%～98.16%，其中变形菌门相对丰度最高，均超过29.61%，为山地草甸土壤细菌优势类群。不同菌门对封育的响应不同，表现为相对丰度增加的细菌数目要大于相对丰度减少的细菌数目，与放牧区相比，封育后0～10 cm土层酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度分别显著增加16.30%～17.16%和34.59%～35.14%(P<0.05)，其中变形菌门在0～5 cm土层显著增加1.88%，但在5～10 cm土层显著降低4.20%(P<0.05)。

在温性草原草地放牧区和封育区0～10 cm土层主要菌门分别为放线菌门、酸杆菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和泉古菌门(图2)，其相对丰度范围依次为25.49%～32.17%，20.00%～21.61%，18.08%～20.67%，5.64%～11.38%，6.01%～7.61%，5.38%～7.25%，4.84%～6.18%和1.19%～1.70%，这8个主要菌门丰度和达96.27%～97.24%，其中放线菌门为优势菌门。封育后温性草原草地菌门丰度增加的细菌数量要少于细菌减少的数量，相比于放牧区，封育区变形菌门相对丰度显著增加5.95%～6.16%(P<0.05)，其余菌门虽有一定幅度的增减但变化均不显著。

图2 封育对温性草原草地不同土层在细菌门水平相对丰度的影响Fig.2 Effects of grazing exclusion on relative abundance of phylum in different soil layers of warm steppe

2.2 封育对不同草地类型土壤细菌α多样性的影响

由图3a～3d可知，与放牧区相比，封育后山地草甸草地0～5 cm土层Chao 1指数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数均呈极显著增加9.53%，3.25%和0.08%(P<0.01)，OTUs显著增加9.68%(P<0.05)，在5～10 cm土层细菌α多样性指标均分别极显著增加16.30%，16.24%，4.74%和0.15%(P<0.01)。不同土层放牧区和封育区相比，封育区细菌α多样性之间差异不显著，而放牧区不同土层细菌多样性相比差异显著(P<0.05)。

图3 封育对山地草甸草地不同土层土壤细菌α多样性的影响Fig.3 Effects of grazing exclusion on soil bacterial α diversity in different soil layers of mountain meadow注：**表示同一土层不同处理间差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示不同土层不同处理间差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示不同土层不同处理间差异不显著(P>0.05)Note:**It indicates that the difference between different treatments of the same soil layer is extremely significant at the 0.01 level,different lowercase letters indicate significant difference between different soil layers and different treatments at the 0.05 level,the same lowercase letters indicate that there is no significant difference between different soil layers and different treatments at the 0.05 level

不同草地类型土壤细菌α多样性对封育的响应不一致(图4a～4d)。在温性草原草地0～10 cm土层围栏封育后均无显著变化，且不同土层放牧区和封育区相比较差异也均不显著。

图4 封育对温性草原草地不同土层土壤细菌α多样性的影响Fig.4 Effects of grazing exclusion on soil bacterial α diversity in different soil layers of warm steppe

2.3 植物特征和土壤特性对不同草地类型封育前后土壤细菌群落组成的影响

对山地草甸草地0～5 cm土层冗余分析可得，第一、二轴累计解释率分别为29.62%和21.97%，5～10 cm土层一、二轴解释率略微升高，分别为29.80%和22.19%(图5)。在0～5 cm土层影响细菌群落的主要环境因子有7个，其中植物盖度、土壤含水量、土壤有机碳和植物Patrick指数是驱动放牧区细菌群落变化的主要环境因子，pH值、电导率和土壤容重是驱动封育区细菌群落变化的主要环境因子。随着土层深度的增加，驱动放牧区细菌群落变化的主要环境因子减少(植物Patrick指数和植物盖度)。

图5 山地草甸草地不同土层细菌组成与环境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of bacterial composition and environmental factors in different soil layers of mountain meadow grassland注：H，植物Shannon-Wiener指数；
S，植物Patrick指数；
SOC，土壤有机碳；
SM，土壤含水量；
AGB，地上生物量；
EC，电导率；
BD，容重；
Coverage，植物盖度。下同Note:H,Shannon-Wiener index of plants;S,Plant Patrick index;SOC,Soil organic carbon;SM,Soil moisture;AGB,Aboveground biomass;EC,Electrical conductivity;BD,Bulk density;Coverage,Plant coverage.The same as below

在温性草原草地0～10 cm土层，通过RDA分析表明第一、二轴解释率分别为25.68%，21.70%，27.57%和21.82%(图6)，影响其0～5 cm土层细菌群落的主要环境因子有电导率、土壤含水量、容重、植物Patrick指数、植物盖度和土壤pH值，其中封育区细菌群落与电导率和植物盖度呈正相关，与土壤含水量呈负相关。在5～10 cm土层，地上生物量变成驱动封育区细菌群落变化的主要环境因子，随着土层深度增加，土壤含水量和植物Patrick指数不再是驱动放牧区细菌群落变化的主要因子。

图6 温性草原草地不同土层细菌组成与环境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of bacterial composition and environmental factors in different soil layers of warm steppe

3.1 不同草地类型土壤细菌群落组成对封育的响应

3.2 不同草地类型土壤细菌多样性对封育的响应

土壤微生物多样性是表征微生物群落稳定性的重要指标，对充分反映土壤环境对微生物群落的影响以及评估草地生态系统的健康状况有着重要意义[19]。本研究结果表明，对山地草甸草地实施封育措施后，显著增加了细菌Chao 1指数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数(P<0.01)，这与杨鹏年等[20]对高寒草甸草地研究封育提高土壤细菌Chao 1指数和Shannon-Wiener指数研究结果一致，但与尹亚丽等[11]对高寒草甸草地研究得出土壤细菌多样性在放牧区和封育区变化不显著的研究不一致。造成这种结果的原因：(1)封育增加了地上植物的数量和种类，提高草地植物覆盖度和生物量进而使凋落物量和根系密度增加，这进一步改善了土壤孔隙和结构及其有机质含量，从而更有利于养分的循环来增加土壤细菌多样性[21]；
(2)可能是由于围栏封育消除家畜践踏和人类活动等外界干扰，促进草地群落自然恢复，改善了土壤理化性质，增加其微生物组成和群落结构，从而提高土壤细菌多样性[22]。另外，对于温性草原草地研究发现，封育对细菌α多样性影响不显著，这与张攀[23]对天山北坡温性草原草地的研究结果一致。整体来看，山地草甸草地和温性草原草地对封育的响应结果不同，究其原因可能是水热条件的不同，导致土壤生境的变化，从而使草地细菌α多样性对封育的响应结果不一致[24]。总之，封育有利于山地草甸草地土壤细菌多样性的增加，但对温性草原草地影响并不大。

3.3 植物特征和土壤特性对不同草地类型封育前后土壤细菌群落组成的影响

植物多样性以及土壤特性会影响土壤微生物群落特征[25]，但微生物种类不同，其因环境变化所作出反应也不同。真菌比细菌更依赖碳源和氮源，在演替过程中没有较好的生境时，需不断积累有机质，在前10 a真菌群落组成变化不明显，因此细菌演替速度快于真菌[26]。同样，细菌因环境的改变有较强的反应，可以较快表征土壤健康状况，从而可以反映出10 a围栏封育后草地的恢复程度。大量研究表明，土壤pH值是影响细菌群落的主要环境因子[27-30]，这与本文研究pH值与山地草甸草地封育区细菌群落呈正相关的结果一致，究其原因可能是pH值偏离中性，使其环境对微生物群落产生胁迫压力[31]，限制细菌的生长和生存，从而影响细菌群落组成。同时有学者研究表明，土壤电导率一定程度上可表征土壤pH值和养分状况[32-33]，封育区土壤电导率是驱动山地草甸和温性草原草地细菌群落组成的主要环境因素，土壤电导率升高，一定程度上加强土壤养分的转化[34]，从而促进细菌相对丰度升高，进一步得出细菌组成对围栏封育有较好响应，封育一定程度上对退化草地的恢复有促进作用。

从细菌相对丰度来看，封育显著增加山地草甸草地0～5 cm土层变形菌门，0～10 cm土层酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度(P<0.05)；
同时显著增加温性草原草地0～10 cm土层变形菌门相对丰度(P<0.05)，表明封育对两种草地类型土壤细菌组成均有促进作用。从细菌α多样性来看，封育极显著提高山地草甸草地细菌α多样性(除0～5 cm土层OTUs数目)(P<0.01)；
但对温性草原草地细菌α多样性无显著影响。冗余分析表明，山地草甸草地封育区细菌群落组成的主要驱动因子为pH值、电导率和土壤容重；
而温性草原草地封育区细菌群落组成的主要驱动因子为地上生物量、电导率和植物盖度。

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