李玉洁，杨雨婷，杨国平,2△

(大理大学:1.基础医学院医学微生物学及免疫学教研室；
2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000)

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病，也是单一感染性病原体导致的最大死因[1]。WHO在《2021年全球结核病报告》中估计，2020年全球新增TB病例987万例，因TB死亡病例达128万例，TB仍对人类生命健康造成严重威胁。因此，寻找MTB特异性抗原以用于早期免疫学诊断对于TB的防治意义重大[1]。PE/PPE蛋白是MTB独有的蛋白家族，参与MTB与宿主细胞间的相互作用，其编码基因约占MTB整个基因组的10%，对MTB的毒力、抗原变异及免疫逃逸作用至关重要[2]。Rv2107基因编码的PE22蛋白为PE蛋白家族成员之一，能够抑制巨噬细胞的凋亡，从而增强耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活[3]，且PE22/PPE36蛋白复合物可能共同分泌并定位于细胞表面，作为血红素受体发挥作用，竞争性地获取宿主细胞铁离子，最终有利于MTB的生长和致病[4]。上述研究表明，PE22可能作为MTB的毒力因子参与机体MTB感染过程中的抗原变异和免疫逃逸过程，但其生物学功能尚未得到证实。为此，本研究对Rv2107基因编码的PE22蛋白进行原核表达与生物信息学分析，为PE22蛋白在MTB感染过程中发挥的免疫学功能及作为疫苗候选抗原的研究提供基础。

1.1材料

1.1.1菌株与质粒 卡介苗(BCG)菌株和pET-32a表达质粒均由大理大学基础医学院医学微生物学及免疫学教研室保存并提供。

1.1.2主要试剂及仪器 大肠埃希杆菌(E.coli) DH5α菌株、E.coliBL21(DE3)菌株、DNA2000 Marker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒与Pro-light辣根过氧化物酶(HRP)化学发光检测试剂均购于北京天根生化科技有限公司；
pMD18-T载体购于北京Takara公司；
T4 DNA连接酶购于上海Themo Fisher公司；
限制性核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购于上海Fermentas公司；
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)、蛋白 Marker与小鼠抗组氨酸(his)标签抗体均购于北京Solarbio公司；
HRP标记的羊抗鼠免疫蛋白G(IgG)购于北京中杉公司。HZQ-X500大型恒温振荡器购于上海一恒科学仪器有限公司；
ABI 2720 PCR仪、Nanodrop 2000微量紫外可见分光光度计均购于上海Themo Fisher公司；
5804R冷冻高速离心机购于德国Eppendorf公司；
Scientz-ⅡD超声波细胞粉碎机购于宁波新芝生物科技股份有限公司；
EV-180垂直电泳槽、Gel DocTMEZ全自动凝胶成像系统均购于上海Bio-Rad公司；
Image Quant LAS 4000 mini化学发光成像系统购于杭州Ge Healthcare Bio Sciences Ab公司。

1.2方法

1.2.1Rv2107基因的PCR扩增及重组表达质粒PE22-pET-32a的构建 通过Primer Premier 5.0软件对Rv2107的基因序列进行酶切位点分析及上下游引物设计，并交由昆明擎科生物公司合成。以BCG基因组(H37Rv中Rv2107基因与BCG完全一致)为模板，Rv2107-F(正向)：5′-GGAATTCATGTCCT TTGTG-3′为上游引物，Rv2107-R(反向)：5′-CCCAAGCTTTTAGAAACC-3′为下游引物，PCR扩增Rv2107基因。反应体系25 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，加双蒸馏水(ddH2O)至25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；
72 ℃延伸10 min。Rv2107基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后连接至pMD18-T载体，热击转入E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素的LB固体选择培养基培养后PCR及双酶切鉴定，对鉴定正确的重组质粒PE22-pMD18-T送昆明擎科公司测序鉴定。EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切测序正确的重组质粒PE22-pMD18-T及表达载体pET-32a，将于pMD18-T载体上酶切的Rv2107基因经T4 DNA连接酶连接至pET-32a载体，获得重组表达质粒PE22-pET-32a后热击转入E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素的LB固体选择培养基培养后，挑取阳性单克隆菌落并PCR鉴定阳性菌落。提取重组表达质粒PE22-pET-32a后热击转入E.coliBL21感受态细胞，获得含PE22-pET-32a的BL-21菌株，并PCR鉴定阳性菌落。

1.2.2PE22蛋白的表达、纯化及鉴定 含重组质粒PE22-pET-32a的BL-21菌株在200 r/min、37 ℃条件于含氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜，次日以1∶100比例扩大培养至A600 nm值为0.6，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.5 mmol/L)诱导表达6 h后，离心收集菌体并超声破碎，对上清及沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分析，检测蛋白表达形式。将沉淀中以包涵体形式表达的PE22蛋白以8 mol/L尿素溶液溶解变性，采用Ni-NTA纯化，经6、4、2、0 mol/L尿素溶液依次复性后，使用10、20、50 mmol/L咪唑溶液依次洗涤杂蛋白，以500 mmol/L咪唑溶液洗脱获得目的蛋白。得到的纯化PE22蛋白经SDS-PAGE电泳后，300 mA、65 min湿转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，经TBST缓冲液洗涤3次后，以小鼠抗his标签抗体为一抗室温孵育1 h后4 ℃孵育过夜，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗室温孵育1 h，Pro-light HRP化学发光检测试剂为显影剂进行蛋白质印迹法(Western bolt)鉴定。

1.2.3PE22蛋白的生物信息学分析 通过Expasy ProtParam软件分析PE22蛋白的理化性质，TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0 Server软件预测PE22蛋白的跨膜区和信号肽，NetPhos-3.1软件预测PE22蛋白的磷酸化位点，Motif Scan软件预测PE22蛋白的翻译后修饰位点，Cell-PLoc2.0软件预测PE22蛋白的亚细胞定位，SOPMA软件预测PE22蛋白的二级结构，SWISS MODEL软件预测PE22蛋白的三级结构，ABCpred和SYFPEITHI软件预测PE22蛋白的抗原表位。

2.1Rv2107基因的PCR扩增及重组表达质粒PE22-pET-32a的构建 以BCG基因组为模板进行PCR扩增，获得大小约为297 bp的特异性片段，与预期一致，表明目的基因Rv2107扩增成功，见图1A。连接Rv2107基因至pMD18-T载体获得重组克隆质粒PE22-pMD18-T，并经EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切后，获得297 bp大小的清晰条带，测序鉴定表明Rv2107的PCR产物与NCBI中NC_000962.3序列完全一致，表明重组克隆质粒PE22-pMD18-T构建成功，见图1B。将PE22-pMD18-T重组克隆质粒上酶切下的Rv2107基因克隆至pET-32a表达载体，获得含PE22-pET-32a的DH5α菌，经PCR阳性鉴定获得297 bp大小的特异性片段，见图1C。

A.Rv2107的PCR扩增产物(M为DNA Marker；
1为PCR扩增产物)；
B.重组克隆质粒PE22-pMD18-T的双酶切鉴定(M为DNA Marker；
1为PCR产物；
2为双酶切产物)；
C.含重组表达质粒PE22-pET-32a的DH5α菌的菌落PCR鉴定(M为DNA Marker；
1、2为阳性菌落的PCR产物)。

2.2PE22蛋白的表达、纯化及鉴定 提取含重组表达质粒PE22-pET-32a的DH5α菌的重组质粒转入E.coli BL21感受态细胞后，经0.5 mmol/L IPTG诱导表达及SDS-PAGE电泳分析得出，PE22蛋白以包涵体形式表达；
诱导表达的PE22蛋白经Ni-NTA纯化、500 mmol/L咪唑溶液洗脱后可见大小约为29 000的单一目的条带，与预期一致，见图2A。Western blot显示，相对分子质量29 000大小位置处可见清晰条带，见图2B。

A.PE22蛋白的SDS-PAGE电泳分析(M为Marker；
1为诱导沉淀；
2为诱导上清；
3为空载诱导沉淀；
4为空载诱导上清；
5为纯化PE22蛋白)；

B.Western blot鉴定PE22蛋白(M为Marker；
1为PE22蛋白)。

2.3PE22蛋白的生物信息学分析

2.3.1PE22蛋白的一般理化性质 通过Expasy ProtParam软件对PE22蛋白的理化性质进行分析，结果显示PE22蛋白的相对分子质量为10 373.77，理论等电点为6.82，分子式为C463H722N126O139S3，由98个氨基酸组成，其中丙氨酸(Ala)占17.3%，缬氨酸(Val)占10.2%，丝氨酸(Ser)占9.2%，带正电荷的氨基酸残基(Asp、Glu)总数为7，带负电荷的氨基酸残基(Arg、Lys)总数为7。PE22蛋白的脂肪族氨基酸指数为81.18%，在A280 nm波长处消光系数为4470，不稳定指数为23.29，属于稳定蛋白，亲水性平均系数为0.121。通过ProtScaleon Expasy软件对PE22蛋白的亲疏水性进行分析，结果显示单个氨基酸的亲水系数最小值为-1.722，最大值为1.733，预测PE22蛋白为疏水性蛋白。见图3。

图3 PE22蛋白亲疏水性预测

2.3.2PE22蛋白的跨膜结构、信号肽、磷酸化位点及翻译后修饰位点 通过TMHMM Server v.2.0软件对PE22蛋白的跨膜结构进行预测，结果显示PE22蛋白无跨膜区，为非跨膜蛋白。见图4。

图4 PE22蛋白跨膜区预测

通过SignalP 5.0 Server软件对PE22蛋白进行信号肽预测，结果显示PE22蛋白N端无信号肽序列，为非分泌蛋白，可能不发生跨膜转移，只于合成处发挥作用。见图5。

图5 PE22蛋白信号肽预测

通过Cell-PLoc 2.0软件对PE22蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示PE22蛋白定位于细胞壁,可能为MTB表面细胞壁蛋白，介导MTB与宿主细胞间的相互作用；
通过NetPhos-3.1软件对PE22蛋白的磷酸化位点进行预测，结果显示PE22蛋白含4个丝氨酸磷酸化位点，4个苏氨酸磷酸化位点，1个酪氨酸磷酸化位点。见图6。

图6 PE22蛋白磷酸化位点预测

通过Motif Scan软件对PE22蛋白的翻译后修饰位点进行预测，结果显示PE22蛋白含有N-豆蔻酰化位点(10～15、22～27位)、蛋白激酶A磷酸化位点(49～52位)、蛋白激酶C磷酸化位点(36～38、48～50位)，磷酸化有利于蛋白质的活性与功能并可催化蛋白质间的相互作用，表明PE22蛋白可能通过调控宿主细胞生命活动发挥生物学功能。

2.3.3PE22蛋白的二、三级结构 通过SOPMA软件对PE22蛋白的二级结构进行预测，结果显示PE22蛋白含α-螺旋(Hh)结构70个，占71.43%，无规则卷曲(Cc)结构16个，占16.33%，β-转角(Tt)结构7个，占7.14%，延伸链(Ee)结构5个，占5.10%，见图7，其无规则卷曲含量较高，表明PE22蛋白容易与抗体嵌合，从而发挥抗原作用。

图7 PE22蛋白二级结构预测

通过SWISS MODEL软件对PE22蛋白序列进行分析，以PE25-PPE41-EspG5三聚体复合物为模板构建PE22蛋白的三级结构同源模型，见图8。其Hh含量较高，与蛋白的二级结构预测相符，GMQE(全球性模型质量评估)值0.68，QMEAN(定性模型分析)值0.73。

图8 PE22蛋白同源建模三级结构

2.3.4PE22蛋白的抗原表位 通过ABCpred软件对PE22蛋白序列进行分析，结果显示PE22蛋白含有10个B细胞抗原表位(临界值0.68)。见表1。

表1 PE22蛋白B细胞抗原表位预测

续表1 PE22蛋白B细胞抗原表位预测

通过SYFPEITHI软件对PE22蛋白序列进行分析，结果显示PE22蛋白含有13个T细胞抗原表位(临界值13)。见表2。

表2 PE22蛋白T细胞抗原表位预测

通过SYFPEITHI软件对PE22蛋白序列进行分析，结果显示PE22蛋白含有12个限制性CTL细胞表位(临界值16)。见表3。

表3 PE22蛋白CTL细胞抗原表位预测

TB是威胁人类生命健康的重要公共卫生问题之一，筛选MTB特异性抗原，建立快速、敏感的生物分子诊断检测可辅助筛查TB，有效控制TB的传播，具有十分广阔的发展前景[5]。而生物信息学以基因组DNA序列信息为源头模拟蛋白质空间结构，从而预测特定蛋白的功能，可有效筛选特异性抗原，已广泛应用于多种疾病的诊断与药物、疫苗的研发[6-7]。

研究表明，Rv2107基因编码的PE22蛋白可通过参与MTB对宿主细胞铁离子的摄取，促进机体MTB的生长和致病，诱导机体产生免疫应答，可能具有较强的免疫原性，有望成为TB疫苗的靶点。因此，进一步分析PE22蛋白在Mtb感染过程中的作用机制可为TB的防治提供新的思路[8-9]。本实验将经PCR扩增的Rv2107基因克隆至表达载体pET-32a，并经PCR阳性鉴定证实重组质粒PE22-pET-32a构建成功，且含重组质粒PE22-pET-32a的BL21菌株表达蛋白以包涵体形式存在。而生物信息学分析显示，PE22蛋白为疏水性蛋白，这也与原核表达获得包涵体形式表达的PE22蛋白一致。研究表明，E.coli大肠杆菌内不溶性蛋白质颗粒大量积累、聚集、折叠不完全而形成的包涵体，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗宿主细胞蛋白酶的攻击，有效发挥抗原作用；
研究表明，蛋白的磷酸化修饰可影响包括蛋白酶活性调节、蛋白构象改变、蛋白相互作用、蛋白稳定性及连接其他蛋白分子能力在内的细胞生命活动的所有过程，而PE22蛋白含有的多个磷酸化位点及翻译后修饰位点显示PE22蛋白可能参与调控宿主细胞信号传导通路的磷酸化状态，介导细胞间的信号转导过程[10-11]；
蛋白跨膜区、信号肽及亚细胞定位分析表明PE22蛋白为细胞壁相关蛋白，暴露于细菌表面，无跨膜区与信号肽，可能通过促进MTB与宿主间的相互作用促进机体MTB的扩散。这些研究提示，PE22蛋白可能具有较强的免疫原性，通过激活机体免疫反应发挥免疫防御效应。此外，蛋白二级结构分析表明PE22蛋白含有大量Hh (71.43%)与Cc (16.33%)结构，其中Hh模体为保守序列，在DNA结合基序中发挥重要作用，Cc多含有B细胞优势抗原表位，有利于蛋白质与抗体的嵌合[12-13]；
抗原表位综合分析表明，PE22蛋白含有多个B细胞、T细胞抗原表位，其中B细胞抗原表位可与游离的抗体分子结合激活机体体液免疫，T细胞抗原表位可与机体T淋巴细胞表面的抗原受体结合激活细胞免疫，这些分析提示PE22蛋白可作为潜在抗原用于免疫诊断或TB疫苗的研究[14]。而由于预测软件的局限性和机体免疫反应的复杂性，PE22蛋白在MTB感染过程中发挥的作用尚不明确，但可以此为参考推测蛋白的功能并筛选出新的抗原靶位，用于新型结核疫苗的研制。

综上所述，重组表达质粒PE22-pET-32a转入BL21菌株后可经IPTG诱导、亲和层析法纯化得到重组蛋白PE22，为进一步研究蛋白的生物学功能提供基础。而生物信息学分析表明PE22蛋白具有较强的免疫原性，可通过激活机体免疫反应发挥抗MTB感染作用，并作为优势抗原用于TB早期诊断或候选疫苗的研究。后续将通过研究PE22蛋白对巨噬细胞功能的影响进一步分析PE22在MTB感染过程中发挥的作用，以期有助于TB的防治。

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