张嘉懿， 格根图*， 贾玉山， 王志军， 张佳伟， 闫星全， 司 强， 赵牧其尔， 孙 林

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室， 内蒙古 呼和浩特 010019；

2.内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031)

苦荬菜(Lactucaindica)原产于亚洲，由野生的山莴苣驯化栽培而来[1]，是菊科莴苣属一年生或二年生草本植物,因其具有产量高、适应性强、适口性好等特点，适宜在我国大部分地区种植[2]，是一种优质的青绿饲料作物。苦荬菜可以直接青饲利用，但是生产季节收获的苦荬菜堆积存放时容易发霉变质导致品质变差，无法在非生长季节为畜禽提供优质苦荬菜[3]。

青贮是保留牧草营养成分、延长牧草保存时间、解决牧草生产季节不均衡的一种方法[4]。苦荬菜由于含水量高，可溶性碳水化合物含量较低，直接青贮很难获得优质青贮饲料[5]。有研究发现，加入添加剂可以改善畜禽饲料的青贮品质[6]。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)是青贮调制中较为常用的两种乳酸菌添加剂。植物乳杆菌属于同型发酵乳酸菌，在青贮发酵时能产生大量的乳酸，迅速降低pH值，提高发酵品质。谢晓华等[7]研究表明，添加植物乳杆菌使青贮小麦(Hordeumvulgare)的乳酸菌数量增加，同时pH值和氨氮浓度下降。Parvin等[8]研究表明，在多花黑麦草(Loliummultiflorum)中添加植物乳杆菌能显著提高发酵品质，但是也显著降低了乳酸菌数量。布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，可将青贮饲料中的营养物质和乳酸分解为乙酸、丙二醇等，使得酵母菌、霉菌等有害微生物的生长被有效抑制。王磊等[9]研究表明，布氏乳杆菌可以降低高湿玉米(Zeamays)青贮饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，改善青贮发酵品质。Gandra等[10]研究表明，在向日葵(Helianthusannuus)中添加布氏乳杆菌可以降低干物质含量，增加乳酸菌数量，同时抑制酵母菌和霉菌的活动。

目前植物乳杆菌和布氏乳杆菌多用于苜蓿、玉米、燕麦等植物的青贮中，而对苦荬菜青贮的研究鲜有报道。因此，本试验旨在探究植物乳杆菌和布氏乳杆菌对苦荬菜青贮品质的影响，筛选出适合苦荬菜青贮添加的乳酸菌，为苦荬菜用作青贮饲料的生产提供理论基础。

1.1 材料

青贮原料为内蒙古农业大学自主培育的苦荬菜品种—‘蒙早’苦荬菜(Lactucaindica‘Mengzao’)，2021年5月8日在内蒙古农业大学温室牧草试验地播种，于2021年8月17日盛花期人工刈割，留茬高度3 cm，利用铡刀切短至1～2 cm，自然状态下阴干约10 h，待含水量降至60%～65%进行青贮调制。添加剂：植物乳杆菌和布氏乳杆菌均购自山东中科嘉亿生物工程有限公司。

1.2 试验设计

试验设置4个处理：即对照(CK组，无添加剂)、单独添加植物乳杆菌(LP组，0.01 g·kg-1)、单独添加布氏乳杆菌(LB组，0.01 g·kg-1)和混合添加植物乳杆菌和布氏乳杆菌(LP+LB组，0.01 g·kg-1+0.01 g·kg-1)，添加量均为鲜重基础，活菌数1.0×1010cfu·g-1，将添加剂溶于30 mL蒸馏水中，用喷壶喷洒在切短的原料上，对照组喷洒等量蒸馏水，每个处理3次重复，后装入做好标记的聚乙烯袋中，每袋200 g抽真空密封，室温条件下避光、干燥保存。青贮60 d后开袋测定其相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1营养成分 青贮60天后开袋将青贮样品称鲜重后，置于恒温鼓风干燥箱内105℃杀青30 min，65℃烘干至恒重，称干重。将烘干的样品过不同目筛粉碎，混合均匀装自封袋，用于测定营养成分。

干物质(Dry matter，DM)含量采用烘干法进行测定[11]；
粗灰分(Crude ash，Ash)含量采用550℃灼烧法进行测定[11]；
粗蛋白质(Crude protein，CP)含量使用全自动杜马斯定氮仪进行测定[12]；
酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)含量使用ANKOM A2000i型全自动纤维仪进行测定[13]；
粗脂肪(Ether extract，EE)含量采用索氏提取法进行测定[11]；
可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)采用蒽酮-硫酸比色法进行测定[14]。

1.3.2发酵品质 青贮60天后开袋将青贮样品充分混合均匀，称取10 g青贮样品置于聚乙烯拍打袋中，并加入90 mL无菌水，用匀质仪拍打2 min后过滤，所得滤液分成两份，分别用于测定发酵品质和微生物数量。使用pH计测定滤液的pH值；
有机酸含量使用高效液相色谱仪(HPLC)测定，利用0.22 μm的水系滤膜对滤液进行过滤后注入进样小瓶中，上机测定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)、丁酸(Butyric acid，BA)含量；
氨态氮(Ammonia-nitrogen，NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定[15]。

1.3.3微生物数量 将另一份滤液用无菌水按10倍稀释法依次稀释至10-1，10-3，10-5，采用平板计数法[16]测定青贮饲料中乳酸菌(Lactic acid bacteria)、一般好氧性细菌(Aerobic bacteria)、大肠杆菌(Coliform bacteria)、酵母菌(Yeasts)和霉菌(Molds)数量。乳酸菌使用乳酸菌固体(De Man，Rogosa，Sharpe，MRS)培养基30℃厌氧培养48 h后计数；
一般好氧性细菌使用营养琼脂(Nutrient Agar，NA)培养基30℃培养48 h后计数；
大肠杆菌使用大肠杆菌/大肠菌群液体显色(Blue light broth，BLB)培养基30℃培养48 h后计数；
酵母菌和霉菌使用马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基30℃培养48 h后计数，所得数据用lg cfu·g-1of FM表示。

1.4 数据处理

利用Microsoft excel 2010处理数据，采用SAS 9.2对数据进行单因素方差分析，最终结果用“平均值±标准差”表示。同时利用模糊数学隶属函数法[17-18]对不同处理的青贮品质进行综合评价，首先分别计算各指标的隶属函数值，然后按照不同指标隶属函数值的平均值进行排名。

如果某个指标与青贮品质正相关，计算公式如下：

U(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

如果某个指标与青贮品质负相关，则用反隶属函数进行计算，计算公式如下：

U(X)=1―(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：U(X)为隶属函数值，X为某一指标的测定值，Xmax和Xmin为所有处理中某一指标的最大值和最小值。

2.1 苦荬菜青贮原料的营养成分及微生物数量

由表1可知，‘蒙早’苦荬菜原料的DM含量为27.28%，Ash含量为9.32%，CP含量为10.08%，NDF含量为57.40%，ADF含量为49.31%，EE含量为3.80%，WSC含量为2.02%。原料里一般好氧性细菌的数量最多，为6.45 lg cfu·g-1FM，酵母菌数量和大肠杆菌数量次之，分别为4.55 lg cfu·g-1FM和4.09 lg cfu·g-1FM，数量最少的是乳酸菌，为3.84 lg cfu·g-1FM，同时检测出霉菌，为3.00 lg cfu·g-1FM。

表1 苦荬菜青贮原料的营养成分及微生物数量Table 1 Nutritional components and fermentation quality of Lactuca indica silage raw materials

2.2 乳酸菌添加剂对青贮饲料营养成分的影响

由表2可知，青贮60 d后，LB组的DM含量显著低于CK组(P<0.05)，其他各组之间无显著差异；
添加剂组的CP含量均显著低于CK组(P<0.05)；
CK组的WSC含量显著高于LB组和LP+LB组(P<0.05)；
各处理组之间的Ash，NDF，ADF和EE含量均无显著差异。

表2 乳酸菌添加剂对青贮饲料营养成分的影响Table 2 Effect of lactic acid bacteria additives on nutritional components of silage

2.3 乳酸菌添加剂对青贮饲料发酵品质的影响

由表3可知，添加剂组的pH值均显著低于CK组(P<0.05)，其中LP组的pH最低，为4.67；
LP组和LP+LB组的LA含量显著高于其他组(P<0.05)，且LP组的LA含量高于LP+LB组，但差异不显著；
LB组的AA含量显著高于其他处理组(P<0.05)；
各添加剂组的NH3-N/TN均显著高于CK组(P<0.05)；
各处理组中均未检测出丙酸和丁酸。

表3 乳酸菌添加剂对青贮饲料发酵品质的影响Table 3 Effect of lactic acid bacteria additives on fermentation quality of silage

2.4 乳酸菌添加剂对青贮饲料微生物数量的影响

由表4可知，各添加剂组的乳酸菌数量均显著高于CK组(P<0.05)，其中LP组的乳酸菌数量最多，为7.71 lg cfu·g-1FM；
各处理组的一般好氧性细菌数量无显著差异；
LB组的酵母菌数量显著低于CK组(P<0.05)；
各处理组中均未检测出大肠杆菌和霉菌。

表4 乳酸菌添加剂对青贮饲料微生物数量的影响Table 4 Effect of lactic acid bacteria additives on microbial quality of silage

2.5 青贮饲料品质的隶属函数综合评价

本试验采用隶属函数法，以CP，WSC，乳酸菌，LA，AA，NDF，ADF，pH值，NH3-N/TN，酵母菌10个指标，对苦荬菜4个处理的青贮品质进行多指标综合评价。隶属函数平均值越高表明该处理的青贮品质越好，结果如表5所示，青贮品质最好的是LP组，其次是LP+LB组和CK组，最差的是LB组。

表5 乳酸菌添加剂对青贮饲料品质影响的综合评价Table 5 Comprehensive evaluation of the effect of lactic acid bacteria additives on silage quality

3.1 乳酸菌添加剂对苦荬菜青贮饲料营养成分的影响

营养成分是反映饲料品质的重要指标，通过营养成分可以直观地评价饲料品质的优劣[9]。唐振华等[19]研究发现在甘蔗尾青贮中添加20 mL布氏乳杆菌菌液显著降低了DM含量。Reich等[20]研究认为添加布氏乳杆菌会造成青贮饲料干物质含量的损失。本试验中，LB组的DM含量显著低于CK组，这与上述研究结果一致，这可能是因为在青贮过程中，布氏乳杆菌将乳酸分解为乙酸、1，2-丙二醇、乙醇和CO2时需要降解可溶性碳水化合物提供能量，而可溶性碳水化合物的降解会降低DM含量[21]。各添加剂组的CP含量均显著低于CK组，可能由于添加剂的加入使青贮饲料中的植物蛋白酶和附着的微生物共同反应，导致CP被降解成多肽、游离氨基酸和氨，CP含量减少[22]。WSC是青贮发酵中微生物产生乳酸等有机酸的底物。相比CK组，添加剂组的WSC含量均下降，这与Contreras-Govea等[23]研究结果不一致，主要是因为添加剂组的乳酸菌数量多于CK组，使得乳酸菌发酵需要消耗更多的WSC，所以剩余较少的WSC。其中LB组的WSC含量最低，原因可能是布氏乳杆菌在青贮发酵过程中除了产生乳酸外，还需要消耗WSC去产生乙酸。

3.2 乳酸菌添加剂对苦荬菜青贮饲料发酵品质的影响

青贮发酵过程中，pH值，LA，AA，PA和BA含量是评价发酵品质的重要指标。在本试验中，与CK组相比，各添加剂组的pH值均显著降低，这与侯健健等[24]的研究结果相似，说明添加乳酸菌能有效地降低苦荬菜青贮饲料的pH值。其中LB组的pH值略高，可能是因为布氏乳杆菌将青贮过程中所产生的部分LA分解并转化为AA，刘辉等[25]也得到了相同的研究结果。本试验中，LP组的LA含量显著高于除LP+LB组以外的其他两组，而LB组的AA含量显著高于其他处理组，这与Winters等[26]的研究结果一致，植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中能产生大量LA，而布氏乳杆菌是异型发酵乳酸菌，在厌氧条件下将部分LA直接分解转化为AA。而LP+LB组LA含量低于LP组但高于LB组，AA含量高于LP组但低于LB组，说明混合添加不同发酵类型的乳酸菌可以提高苦荬菜青贮饲料的LA和AA含量，这与司华哲等[27]研究结果一致。NH3-N/TN可以反映青贮饲料中蛋白质和氨基酸的降解情况，本试验中，各添加剂组的NH3-N/TN均显著高于CK组，说明加入添加剂后苦荬菜青贮饲料中的蛋白质经蛋白酶分解后参与体内代谢活动产生了NH3-N[28]。各处理组中均未检测出BA，原因可能是添加剂的加入增加了青贮饲料中乳酸菌的数量，抑制有害微生物的不良发酵，降低了BA的含量。

3.3 乳酸菌添加剂对苦荬菜青贮饲料微生物数量的影响

青贮发酵是一个复杂的微生物发酵过程，原料特性、发酵环境及原料附生微生物等因素决定了青贮能否成功[29-30]。有研究表明原料附着的乳酸菌数量大于105cfu·g-1FM时，青贮更容易成功[31]。‘蒙早’苦荬菜附着的乳酸菌数量较少，所以需要额外添加乳酸菌来促进青贮发酵，本试验发现由于不同乳酸菌添加剂的加入，各添加剂组的乳酸菌数量均较CK组显著增加。在青贮饲料发酵过程中，酵母菌的存在往往是不利的，一般会引起饲料青贮品质的腐败变质[32-33]。本试验中添加剂组的酵母菌数量均有所下降，其中LB组的酵母菌数量最少，这可能是因为布氏乳杆菌发酵产生大量乙酸，而乙酸可以有效抑制酵母菌等有害细菌的活动。各处理组中均未检测出大肠杆菌和霉菌，这可能是因为苦荬菜青贮饲料中乳酸菌数量增加，促进青贮发酵快速产生乳酸，pH值下降，抑制了有害微生物大肠杆菌和霉菌的繁殖。

3.4 苦荬菜青贮饲料品质的隶属函数综合评价

青贮饲料的品质是由多个指标共同影响的，不能根据单一指标对其评价。隶属函数法可以在多个指标的基础上对青贮品质进行更全面、可靠的综合评价[34]。本试验采用隶属函数法综合评价苦荬菜4个处理的青贮品质，排名由高到低依次为LP组>LP+LB组>CK组>LB组。LB组的排名在CK组后面，原因可能是LB组的CP和WSC含量在青贮发酵过程中消耗得较多，但其他测定指标相比于CK组得到了改善[35]。

本试验表明，在苦荬菜青贮时单独或混合添加不同发酵类型乳酸菌均能增加乳酸和乙酸含量，降低pH值，从而改善苦荬菜青贮饲料的发酵品质；
采用隶属函数法综合评价，得出LP组的青贮品质最好，说明在调制苦荬菜青贮饲料时添加植物乳杆菌能提高青贮效果。

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