张 杰 张文刚 党 斌 杨希娟,*

(1 青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；
2 青海省农林科学院，青海省青藏高原农产品加工重点实验室，青海 西宁 810016；
3 青藏高原种质资源研究与利用实验室，青海 西宁 810016)

我国青藏高原地区是青稞的起源中心之一，富含多种黑青稞资源[1-3]。黑青稞具有高的膳食纤维、蛋白质、维生素及β-葡聚糖含量[4-5]，同时必需氨基酸、微量元素及花青素类物质的含量[6-7]也普遍高于普通大麦。

目前针对青稞的研究大多集中在不同品种青稞籽粒营养品质评价、活性成分提取工艺优化、活性成分组成分析及功能活性研究等方面，而关于青稞发酵研究的相关报道较少，且主要以青稞酒[8-9]、青稞面制品[10]、青稞酸奶[11]、青稞甜醅[12]为主。而在黑青稞的加工利用研究中也大多以常规青稞加工方式为主，产品种类较为单一。甜醅是一种以青稞或燕麦为原料，经米根霉发酵制成的风味食品[13]，由于其作为一种地方特色小吃，其发酵工艺参数大多以经验为主，导致甜醅产品稳定性差、营养功能成分不明确、风味及口感不理想，严重影响了青稞甜醅产品的消费。因此，将黑青稞作为发酵原料，明确其最佳发酵工艺，不仅可为甜醅产品提供更多的营养品质，同时可为其稳定性及安全性提供保障，有利于黑青稞的产业化发展。

青海省青藏高原农产品加工重点实验室团队前期研究发现米根霉发酵制备的黑青稞制品风味不理想，而酵母菌J7发酵的黑青稞制品具有较好的风味，但其发酵不彻底、青稞基料利用率低。有关学者研究发现混菌发酵具有一定优势，如Chen等[14]采用霉菌和酵母进行混合发酵，结果发现混合发酵后得到的黄酒呈现较浓的花香、酒香、曲香和米香，且风味化合物的总浓度优于市售黄酒；
Ong等[15]以豆渣和啤酒糟为基料，比较米曲霉和枯草芽孢杆菌的单一发酵和混合发酵对基料的影响，结果表明混合发酵的豆渣产生总酚含量最高，且能够显著增加底物的营养成分。基于目前青稞甜醅存在的问题及混菌发酵的优势和应用潜力，本研究选择混菌发酵方式，在提高其营养品质的同时改进其风味，增加其功能成分，旨在为开发新的具有特殊风味的甜醅产品，提高黑青稞的高附加值和利用率提供理论依据。

1.1 材料与试剂

酵母菌J7，由青海省青藏高原农产品加工重点实验室分离西藏灵菇乳得到，经鉴定为单胞酿酒酵母菌；
米根霉发酵剂，湖北安琪酵母股份有限公司；
黑青稞昆仑16号，由青海省农林科学院作物育种栽培研究所提供；
葡萄糖标准品(100 mg)，合肥博美生物科技有限责任公司；
其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

pHS-3C型精密酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；
HH-4型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；
Retavapor R-215 型旋转蒸发仪，瑞士布奇有限公司；
N4S 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；
SW-CJ-2型双人净化工作台，苏州净化设备有限公司；
TGL-20 M 型高速冷冻离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 参照何国庆[16]的方法。用接种环挑取酵母菌J7斜面培养物两环于装有100 mL的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(yeast extact peptone dextrose, YEPD)的三角瓶中，在28℃下培养48 h进行活化，活化3次。

1.3.2 黑青稞发酵工艺流程[17]黑青稞挑选、去杂→清洗→浸泡→沥干→蒸煮→冷却→接菌→发酵→成品。

将发酵后的黑青稞样品进行冷冻干燥并粉碎，过60目筛网备用。

1.3.3 黑青稞混菌固态发酵单因素试验 取昆仑16号青稞，在浸泡时间24 h、常压蒸煮30 min、酵母J7与米根霉比例1∶1(v∶m)、接种量5%、发酵温度28℃、发酵时间48 h的恒定条件下，分别考察发酵温度(20、24、28、32、36和40℃)、发酵时间(12、24、36、48、60和72 h)、接种量(1%、3%、5%、7%、9%)及酵母J7与米根霉比例(5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5)对黑青稞发酵物pH值及氨基酸态氮含量的影响。

1.3.4 响应面试验 根据单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面试验设计方法，以发酵温度、酵母J7和米根霉比例、接种量为显著影响因素，以氨基酸态氮含量为响应值设计三因素三水平响应面试验，试验设计如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面试验设计因素与水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 理化指标测定 氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法[18]；
总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法；
黄酮含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法；
DPPH自由基清除活性参照杨希娟等[19]的方法进行测定；
风味物质参照文献[20]用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)检测法分析。色谱系统采用 GC-MS QP2020，色谱柱型号为SH-Rxi-5 Sil MS。色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250℃；
载气He，流速1.0 mL·min-1，不分流；
升温程序：始温40℃保持2 min，以1℃·min-1升温至100℃，再以4.5℃·min-1升至240℃，保持4 min。质谱条件：EI电离源，能量70 eV；
离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描范围(45～650)m/z。

1.3.6 感官评分 参照文献[21]的方法，以混菌发酵得到的黑青稞制品的外观、香气、口感、质地为评定指标，组织9名(4男5女)经过基础培训的人员对其进行感官评价，取平均值，评分标准见表2。

表2 黑青稞发酵制品感官品质评分标准[21]Table 2 Sensory evaluation standard of sweet fermented black highland barley[21]

1.4 数据统计分析

数据采用平均值±标准偏差表示；
采用 Design-Expert 8.06、SPSS 18.0软件进行数据分析，P<0.05表示显著，P<0.01表示极显著。所有试验均重复3 次。

2.1 混菌发酵最佳工艺的确定

2.1.1 不同接种量对混菌发酵黑青稞制品的影响 由图1可知，随着接种量的增加，黑青稞发酵物的氨基酸态氮含量及感官评分均呈现先增加后减少的趋势，当接种量为5%时，氨基酸态氮含量和感官评分最高，分别为10.48 mg·100 g-1和84.44分。这主要是由于米根霉在发酵过程中自身会代谢蛋白酶系，从而降解黑青稞的蛋白质，其中一部分氮源供微生物利用，而另一部分则分解成为游离氨基酸[17]，使得氨基酸态氮含量增加。同时，接种量过低时，黑青稞发酵物表现出发酵不彻底，发酵产物质地较硬、香气不足、口味较淡的特点，这与Paranthaman等[22]的研究结果一致。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图1 不同接种量对混菌发酵黑青稞氨基酸态含量及感官评分的影响Fig.1 Effect of inoculums amount on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.2 不同发酵温度对混菌发酵黑青稞制品的影响 由图2可知，随着发酵温度的不断升高，混菌型黑青稞发酵制品的氨基酸态氮含量及感官评分均呈现先增加后减小的趋势，当发酵温度为32℃时，氨基酸态氮含量最高，达到8.58 mg·100 g-1，此时感官评分也最高，达到83.56分，混菌型黑青稞制品表现出浓郁的发酵香味、口感较为适宜。这可能是由于所选取的米根霉和酵母菌适宜发酵温度在32℃左右，在该温度下更利于菌株的生长及代谢产物的形成，发酵物风味不断积累，发酵较为彻底，感官品质增加，同时微生物生长旺盛，蛋白酶不断产生，从而使氨基酸态氮含量增加。

图2 不同发酵温度对混菌发酵黑青稞氨基酸态含量及感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.3 不同发酵时间对混菌发酵黑青稞制品的影响 由图3可知，氨基酸态氮含量在0～48 h内随着发酵时间的增加而逐渐增加，且不同发酵时间下均存在显著性差异；
在48～72 h氨基酸态氮含量趋于稳定，基本保持在8.30～8.46 mg·100 g-1之间。感官评分在0～36 h内随着发酵时间的增加而逐渐增加；
在36～60 h趋于稳定，在81.00～83.00分之间；
而当发酵时间超过60 h时，感官评分略有下降。这是因为当发酵时间过短时，微生物增殖较慢、数量较少，导致发酵不彻底，使得青稞中的营养成分未被完全利用，感官品质及氨基酸态氮含量较低；
而发酵时间过长时，由于养分不足，微生物间相互作用，同时大量代谢产物累积使得整个发酵体系的pH值等发生变化[23]，影响发酵感官及氨基酸态氮含量。根据感官评分和氨基酸态氮含量结果，最终确定发酵时间为48 h较为适宜。

图3 不同发酵时间对混菌发酵黑青稞氨基酸态含量及感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.4 不同菌种比例对混菌发酵黑青稞制品的影响 由图4可知，不同菌种比例的黑青稞发酵制品的氨基酸态氮含量存在显著性差异，其中J7∶米根霉比例为1∶3时氨基酸态氮含量最高，为8.77 mg·100 g-1，且当米根霉含量较高时，黑青稞发酵制品的氨基酸态氮含量相对较高，这可能是菌种特性不同所致。与酵母菌相比，米根霉在生长和发酵过程中会产生更多的蛋白酶，这些蛋白酶会作用于黑青稞蛋白，从而产生更多的氨基酸态氮。当J7∶米根霉比例为1∶1、1∶3、1∶5时，感官评分结果无显著性差异，在82.78～84.11分之间。该结果可能是由于米根霉含量更高时能够代谢产生更多的淀粉酶和蛋白酶，促进营养物质的分解及利用[24-25]，增强酵母菌的发酵利用效率，促进风味物质的积累，得到较高品质的青稞甜醅制品。

图4 不同发酵温度对混菌发酵黑青稞氨基酸态含量及感官评分的影响Fig.4 Effect of strain ratio on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.5 响应面试验 本试验在单因素试验的基础上，以氨基酸态氮含量及感官评分为考察响应值，以不同发酵温度(X1)、不同菌种比例(X2)和不同接种量(X3)为因素，采用响应面设计对黑青稞混菌发酵工艺条件进行优化，结果见表3～5。

表3 Box-Behnken响应面试验设计方案及结果Table 3 Experimental design and results for Box-Behnken response surface analysis

表4 回归模型方差分析(氨基酸态氮含量)Table 4 Analysis of variance for regression model (Amnio acid nitrogen content)

表5 回归模型方差分析(感官评分)Table 5 Analysis of variance for regression model (sensory score)

对上述试验结果进行二次回归拟合，建立的回归方程分别为Y1(氨基酸态氮含量)=7.53+1.37X1-1.56X2+0.26X3-1.22X1X2-0.77X1X3-2.67X2X3-2.47X12-2.43X22-0.58X32；
Y2(感官评分)=-434.93+27.53X1+24.58X2+16.95X3-0.28X1X2-0.77X1X3-1.44X2X3-0.39X12-1.88X22-0.33X32。

由表4可知，氨基酸态氮的回归模型极显著(P=0.000 7)，失拟项不显著(P=0.563 8)，说明该模型拟合程度良好，可用于黑青稞发酵工艺条件的分析和预测。对回归系数显著性检验可知，一次项X1和X2、二次项X12、X22以及X2和X3之间的交互作用对黑青稞氨基酸态氮含量的影响极显著，X1和X2之间的交互作用对黑青稞氨基酸态氮含量的影响显著，而X3、X32、X1和X3之间的交互作用对黑青稞氨基酸态氮含量的影响均不显著。由表5可知，感官评分的回归模型极显著(P=0.001 5)，失拟项不显著(P=0.194 7)，说明该模型拟合程度良好。对回归系数显著性检验可知，一次项X1和X2、二次项X12、X22以及X2和X3之间的交互作用对黑青稞感官评分的影响极显著，而X3、X32以及X1和X2、X1和X3之间的交互作用对黑青稞感官评分的影响均不显著。

根据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等高线图。图5～7为因素间具有显著性影响的响应面分析图及等高线图。各参数间的等高线呈椭圆形，响应值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.6.0软件求解方程最大值，得到工艺一：当发酵温度为33℃，发酵时间为48 h，菌种比例为 1∶1.24， 接种量为6.70%时，氨基酸态氮含量最高，达到9.12 mg·100 g-1。

工艺二：当发酵温度为33℃，发酵时间为48 h，菌种比例为1∶1.20，接种量为6.81%时，感官评分最大，为95.22 分。为了检验模型的准确性，在上述两种发酵条件下进行发酵试验，结果如表6所示，经两次试验得到工艺二中氨基酸态氮含量平均值为9.32 mg·100 g-1， 感官评分为95.48 分，均高于工艺一。最终选取工艺二为混菌发酵黑青稞制品的最佳工艺。

图5 发酵温度与菌种比例的交互作用对氨基酸态氮含量的影响Fig.5 Interaction effects of fermentation temperature and strain ratio on the amino acid nitrogen content

图6 发酵温度与接种量的交互作用对氨基酸态氮含量的影响Fig.6 Interaction effects of fermentation temperature and inoculum amount on the amino nitrogen content

图7 接种量与菌株比例的交互作用对感官评分的影响Fig.7 Interaction effects of inoculum amount and strain ratio on sensory score

表6 最佳工艺结果表Table 6 The best process results

2.2 不同发酵方式对黑青稞制品酚类物质含量及抗氧化活性的影响

不同发酵方式对黑青稞制品酚类物质含量及抗氧化活性的影响如图8～10所示。不同发酵方式下黑青稞发酵制品的酚类物质含量及DPPH自由基清除能力存在显著差异，其中混菌发酵方式制备的黑青稞制品的酚类物质含量及DPPH自由基清除能力显著高于其他两种发酵方式，3种发酵方式下发酵得到的黑青稞制品黄酮含量大小依次为J7+米根霉(32.22 mg·100 g-1)>米根霉(27.77 mg·100 g-1)>J7(18.59 mg·100 g-1)；
多酚含量大小依次为J7+米根霉(230.68 mg·100 g-1)>米根霉(206.70 mg·100 g-1)>J7(186.82 mg·100 g-1)；
DPPH自由基清除能力大小依次为J7+米根霉(95.03 μmol·L-1)>米根霉(89.56 μmol·L-1)>J7(83.46 μmol·L-1)，说明混菌发酵黑青稞制品具有较强的DPPH自由基清除能力。

图8 不同发酵方式对黑青稞制品黄酮含量的影响Fig.8 Effects of different fermentation methods on the content of flavonoids in black hulless barley products

图9 不同发酵方式对黑青稞制品多酚含量的影响Fig.9 Effects of different fermentation methods on the content of polyphenols in black hulless barley products

图10 不同发酵方式对黑青稞制品DPPH自由基清除能力的影响Fig.10 Effects of different fermentation methods on DPPH radical scavenging ability of black hulless barley products

2.3 黑青稞混菌发酵对成品风味物质的影响

由表7可知，不同菌种发酵黑青稞的挥发性风味物质在种类和含量上均具有较大差异。酵母菌J7单独发酵的黑青稞中共检出33种挥发性化合物，米根霉单独发酵的黑青稞中共检出41种挥发性化合物，而酵母菌J7和米根霉混菌发酵的黑青稞中共检出46种挥发性化合物，这3种发酵方式下制备得到的黑青稞制品中酯类和烷烃类物质种类最为丰富。

表7 不同发酵方式下挥发性风味物质含量变化Table 7 Changes of volatile flavor compounds in different fermentation methods

表7(续)

由表8可知，不同发酵方式下制备得到的黑青稞制品风味物质的种类和相对含量存在差异，醇类和酯类是3种发酵方式黑青稞制品中主要的风味物质，其中醇类相对含量高达45%以上，是赋予黑青稞发酵制品的主要风味成分。3种发酵方式中，米根霉单独发酵黑青稞制品的酮类、萜烯类、烷烃类物质种类较为丰富，且相对含量较高，分别达到了3.13%、3.98%、8.58%。酵母菌J7单独发酵黑青稞制品的醇类含量仅次于混菌发酵，表现出较浓郁的酒香和果香，且仅在此发酵方式下检测到醛类物质，但含量相对较低，仅为0.63%。混菌发酵黑青稞制品的风味物质种类最多，达到46种，且其醇类、酯类、酸类相对含量均高于其余两种发酵方式，分别达到59.09%、29.44%和6.46%。其中2-乙基-1-丁醇、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基-丙酸乙酯、2-甲基丙酸丙酯、二氧己酸甲酯、2-甲基丁酸丙酯、正丙酸异戊酯、2-丙酸戊醇酯、2-甲基戊酸甲酯、正己酸乙酯、异丁酸2-甲基丁酯、丁酸异戊酯、苯乙酸乙酯、己酸异戊酯、2-苯乙基乙酸酯、正辛酸异丁酯、9-癸烯酸酯、辛酸异戊酯、9-十六碳烯酸乙酯、异丁酸异丁酯、L-乳酸为混菌发酵黑青稞制品特有的风味物质。另外，混合发酵方式制备的黑青稞制品的2，3-丁二醇、2-乙基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸甲酯、八甲基环四硅氧烷均高于其余两种发酵方式，风味物质中的酯类大多赋予发酵制品芳香味、果香味，如辛酸乙酯有似杏、奶油香、牛奶香、甜的酒香香气，癸酸乙酯有果香和酒香香气，2-甲基丁酸乙酯有水果香，苯乙酸乙酯有玫瑰、蜂蜜香气，月桂酸乙酯有甜香、水果香，丁酸乙酯有菠萝香、水果香、花香等[20,26]；
醇类、酸类赋予发酵制品花香味、果香味，如苯乙醇有花香味，香气似栀子花、玫瑰、紫丁香[27]，3-甲基丁醇赋予发酵制品焦糖味[28]，2，3-丁二醇呈黄油、奶油气味等，醇类化合物可使发酵物风味浓厚丰满。综合而言，混菌发酵较单一发酵更利于风味物质的形成，其香味更为丰富、浓郁，说明混菌菌种发酵黑青稞更具优势，且在实际生产实践中具有一定的优越性。

表8 黑青稞发酵制品中挥发性风味物质分类Table 8 Classification of volatile flavor compounds in black hulless barley fermented products

混菌发酵方式能够提高发酵制品品质，改善其风味，但目前对于应用混菌发酵技术提升风味及品质的研究大多集中在黄酒[29]、果酒[30]等制品的发酵生产中，而针对青稞混菌发酵改善发酵制品风味及品质的研究较少。青海省青藏高原农产品加工重点实验室前期研究发现米根霉单独发酵制备的黑青稞制品风味不理想，而酵母菌J7单独发酵的黑青稞制品虽然具有较好的风味，但存在发酵不彻底、青稞基料利用率低的问题。已有研究表明，米根霉和酵母菌混菌发酵后能显著提高燕麦的总酚含量及抗氧化活性[31]。因此，在前期研究的基础上，本研究选取米根霉及酵母菌J7进行混菌发酵，结果显示，经混菌发酵的黑青稞制品氨基酸态氮含量、感官品质、酚类物质含量及抗氧化活性均得到大幅度提高，表明米根霉与酵母菌J7混菌发酵具有协同发酵作用。Chen等[29]采用霉菌和酵母菌混合发酵制备黄酒，结果发现混合发酵的黄酒具有较高的α-淀粉酶含量和感官评分。Hu等[32]研究发现混合发酵的柑橘渣具有更高的营养成分、酚类物质含量及抗氧化活性。以上研究结果与本研究结果一致，均表明混菌发酵能够有效提高发酵物的营养成分、功能物质并改善其风味。这可能是由于两种菌株混合发酵后，米根霉代谢产生更多的淀粉酶[33]、蛋白酶[34]和脂肪酶[35]和琥珀酸等物质，促进了营养物质的分解及利用，而酵母菌主要用于酒精发酵，更能有效利用这些小分子营养物质促进营养功能成分的生成，从而有效改善发酵制品的风味。此外，酚类物质主要以游离态和结合态存在，其中结合态酚类物质多与多糖、蛋白、淀粉、纤维等大分子结合，多数被细胞壁束缚，不能被直接提取出来，而通过微生物产生的酶系能够破坏大分子基团的网状结构并降低细胞壁主要成分的分子量及大小[36-37]，从而获得更多的游离态多酚类物质，提高其生物活性[38]。

风味物质种类及含量的变化可能与混菌发酵微生物的相互作用机制密不可分。洪家丽等[35]研究发现，混菌发酵初期黑曲霉、紫色红曲霉、米根霉和米曲霉米根霉为优势菌株，发酵代谢产生多种酶系，使得整个发酵体系产生有醇类、酸类，由于氧气大量消耗，造成后期这些菌株生长被抑制[39-40]，而到发酵后期酵母菌作为优势菌株进行发酵[41]。此外，史晓萌等[17]探究米根霉与酵母菌混菌发酵燕麦过程中微生物及理化指标的变化也得到同样的结果。因此，推测本研究在前期发酵中以米根霉为优势菌株，由于其代谢酶系的作用，将淀粉及蛋白质进行分解，获得小分子糖类及氮源物质，而后期酵母菌为优势菌株，利用小分子物质产生了较多的风味组分。为此，在后续研究中有必要采用相应的技术手段，进一步确定米根霉和酵母菌在混菌发酵过程中的生长繁殖、相互作用及代谢通路，为混菌发酵黑青稞制品的进一步开发利用提供理论依据。

本研究采用米根霉和酵母菌J7混菌发酵黑青稞甜醅，得到最佳发酵条件为：发酵温度33℃，发酵时间48 h，菌种比例(酵母菌J7∶米根霉)1∶1.20，接种量6.81%，在此最佳发酵条件下测得混菌发酵制品的氨基酸态氮含量为9.32 mg·100 g-1， 感官评分为95.48分。混菌发酵黑青稞甜醅具有较高的酚类物质含量、抗氧化活性、风味物质组成种类及含量，其中3-甲基丁醇、2，3-丁二醇、2-乙基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基-丙酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸甲酯、L-乳酸、3-甲基-1-丁醇乙酸、十甲基环戊硅氧烷、八甲基环四硅氧烷为混菌发酵黑青稞甜醅的主要风味物质。综上所述，混菌发酵制备的黑青稞制品在功能及风味方面具有一定的优势，可进一步开发利用。

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