詹胜群，葛城，周钧，周荣杰，刘金梅，颜复张*

澳优乳业（中国）有限公司（长沙 410200）

婴幼儿配方奶粉是非母乳喂养婴幼儿营养的重要来源，铜、锌元素是人体必需的14种微量元素中的2种[1]。铜参与人体的造血、血红蛋白合成等过程，锌参与机体免疫功能、影响维生素C的代谢等，二者与婴幼儿的生长发育、第二性征发育及智力发育等相关[2-5]。铜、锌还是构成金属酶的必需成分，如含锌的碳酸酐酶、含铜的酪氨酸酶、含二者的超氧化物歧化酶等[6-9]。故准确测定婴配奶粉中铜锌含量与奶粉品质和婴幼儿健康至关重要。

对于奶粉中铜、锌的检测，GB 5009.13—2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》中第二法和GB 5009.14—2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》中第一法给出的FAAS法及GB 5009.268—2016中第一法给出的ICP-MS法是我国常用的强制标准方法[10-12]，由于FAAS法常与干法消解联用，且具有仪器成本低、称样量较多、线性范围广等特点，故被国内不少乳企、检测机构采用。而在ISO 21424—2018中，检测方法是微波消解-ICP-MS法[13-14]，ISO方法是国际标准化组织指导和协调全球检测推荐的标准方法[15-16]，除方法原理与FAAS法有本质区别外，该方法要求奶粉样品复溶，且消解过程添加甲醇、过氧化氢等，样品处理方式差异大。对于有奶粉进出口业务的乳企而言，这种方法间的差异可能导致同一样品的测定结果不一致，从而导致抽检结果无法满足双边监管要求，故研究这2种方法的差异对双边检测结果相互合规合法具有重要指导意义。

1.1 仪器、试剂和标准品

电感耦合等离子体质谱仪（Thermo Scientific™ iCAP Q，赛默飞）；
原子吸收光谱仪（配火焰原子化器，附铜、锌的空心阴极灯，AA240FS，美国瓦里安）；
超纯水制备装置（Milli-Q，美国密理博）；
电子天平（ME204E，梅特勒托利多）；
微波消解仪（ETHOS UP，北京莱伯泰科）；
箱式电阻箱（MFLC16/12A，天津市泰斯特）；
磁力搅拌器（90-2型，上海沪西仪器）。

甲醇（MS级，上海安谱）；
硝酸（MS级，上海安谱）；
30%过氧化氢（GR，天津市科密欧）；
内部质控样（S18，三段，牛奶粉），市售；
外部质控样（QC-IP-701，中国检验检疫科学研究院测试评价中心）；
奶粉样品（S1～S17，市售婴幼儿配方奶粉）；
多元素标准溶液（Cu 2.5 mg/L、Zn 10 mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心）；
锗、碲、铜、锌标准溶液（1 000 mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心）。

1.2 试验方法

1.2.1 比对方案设计

方法比对分为4个部分，见表1。检测过程中2名试验操作者均为实验室有经验的授权人员，每名试验员在相互独立的情况下分别采用GB标准和ISO标准进行样品测试。外部质控样测试得到的数据组成成组资料，样品测试得到的数据组成成对资料。

表1 比对方案

1.2.2 试验样品信息

序号1～17的样品为市售的不同段数（1、2和3段）、不同产地（国产、进口）、不同基质（牛奶、羊奶）的婴幼儿配方奶粉；
序号18～19为质控样。样品信息见表2。

表2 样品基本信息

1.3 数据处理

1.3.1 消解条件

微波消解条件：室温至120 ℃（1 800 W），升温8 min，恒温10 min；
120 ℃至160 ℃（1 800 W），升温8 min，恒温10 min；
160 ℃至180 ℃（1 800 W），升温5 min，恒温20 min。干灰化条件：固体试样约2.5 g于坩埚中，1 000 W电炉加热炭化至无烟，转移至箱式电阻箱中，于550 ℃灰化5 h。

1.3.2 仪器分析条件

ICP-MS条件：等离子功率：1 550 W；
冷却气流：14 L/min；
辅助气流量：0.8 L/min；
雾化气流量：1.074 L/min；
采样深度：5 mm；
重复次数：3次；
采集模式采用跳峰；
雾化室温度2.7 ℃；
氦气流量4.3 mL/min。FAAS条件：波长213.9 nm，狭缝0.2 nm，空气13.50 L/min，乙炔2.00 L/min，测量时间5 s，重复次数3，测量模式采用积分。

1.3.3 数据处理

FAAS信号的采集及定性、定量分析采用Spectr AA（Version：5.1 PRO）软件，ICP-MS信号的采集及定性、定量分析采用Qtegra（Version：2.7 SR1）软件，试验数据的图形绘制和表格制作采用Excel 2019软件和WPS Office 2021软件。

2.1 方法文本比较

2个方法的原理及关键步骤差异见表3。ICP-MS法则采用大样本复溶的方式提高取样的均一性和代表性，理论上ISO方法检测的结果应具有更好的精密度。定量方式上，FAAS法采用外标法，而ICP-MS法采用内标法，且内标加标方式为前处理加标。检出限和定量限上，ICP-MS限值设定得更低。整体上看，2种方法差异较大。

表3 方法文本比较

2.2 方法性能参数比较

重复性试验是评价随机误差大小的方法，由表4可知，对于仪器精密度，FAAS法和ICP-MS法差异并不大，均＜1%，但对于方法精密度，FAAS法相对标准偏差（SRSD）2个指标均大于ICP-MS法，可见ICPMS法方法精密度更好，但2种方法的精密度均符合ISO标准要求（＜5%）和国标要求（＜7.5%），试验的随机误差的控制都在要求范围内。FAAS法和ICPMS法回收率在90%～110%之间，回收率均符合GB/T 27417—2017《化学分析方法确认和验证指南》要求。定量限结果均小于标准规定值。

表4 方法性能参数

2.3 质控样检测比对

由表5可知，检测结果均在标准物质参考值不确定度范围内且均和特性值接近，表明2种方法正确性良好，无大的系统误差影响试验。由表6统计分析结果知两组数据方差具有同质性，可对样本数据进行均数差数t检验和F检验（方差分析）。t检验表明2种方法间铜、锌差异都极显著，铜锌ISO方法检测结果高于GB方法检测结果。铜平均数差数置信区间为4.24～35.89 μg/100 g，置信度为99%；
锌平均数差数置信区间为0.024 1～0.269 mg/100 g，置信度为99%。方差分析见表7，可知同样具有差异极显著的结论。

表5 外部质控样QC-IP-701结果比对

表6 内部质控样检测结果的统计分析

表7 内部质控样测结果的方差分析

由于差异显著性检验的性质，其结论只表示所检验的两处理样本来自同一总体的可能性小于或大于统计上公认的概率水平α（0.05或0.01），并没有提供两处理间的差异有多大的信息，故要对差异进行定量分析还需要结合预先设定等效标准的双向单侧t检验（TOST）来完成方法间的等效性评价[17-20]。预先设定2个等效标准（Δ为5%和10%）检验方法的等效性，由表8可知，铜、锌在等效标准5%内方法均不等效，在10%内方法均等效。

表8 不同等效标准下的TOST检验结果

2.4 样品检测比对

样品的检测结果及结果差值见表9。由图1和图2可看出：铜所有的点均在95%一致性界限以内，界限内差值的绝对值最大为36.49 μg/kg（图中白色点）；
锌有94.1%（16/17）的点在95%一致性界限以内，差值的绝对值最大为0.247 2 mg/kg（图中白色点）。若铜、锌分别以所有测定结果的算数均值的±10%（-39.77，+39.77）μg/kg、（-0.039 13，+0.039 13）μg/kg作为应用可接受的界限，这种相差幅度在应用上均可接受，因此可以认为2种方法测量的结果具有较好的一致性，并且可以互相代替使用[21-26]，且该界限与国标方法中关于铜、锌精密度的规定“在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%”相符合。但铜、锌分别以所有测定结果的均值的±5%为应用可接受界限时，则2种方法相差幅度在应用上均不可接受。配对t检验结果见表10，可知铜差异极显著、锌差异显著，且铜、锌ISO方法检测结果均高于GB方法检测结果。可见对于2种方法间系统误差的判定，样品与质控样的检测比对结果基本一致。

图1 铜Bland-Altman图

图2 锌Bland-Altman图

表9 样品检测结果

接表9

表10 配对t检验结果

以国标标准FAAS法为参考方法，以ISO标准ICPMS法为候选方法。铜、锌测试结果的回归分析分别见图3和图4。线1为以参考方法测定结果为X值、以候选方法为Y值所拟合的回归曲线，线2代表候选方法值=参考方法值，方程为y=x；
线3和线4代表回归曲线95%的置信区间估计。对于铜，线1在线2上，线2未完全落在95%置信区间范围内，表明代表实际测试结果的回归曲线在所分析浓度范围内与标志着2种方法结果一致的参考曲线Y=X在统计学上不一致，即随着X值减小，线2与线1的偏差逐步增大，当X小于400时，线2已不能落在置信区间内，提示随着样品中铜含量降低，2种方法的测定结果差异逐步增大。对于锌，回归曲线与参考曲线有同样的趋势，提示随着样品中锌含量降低，2种方法的测定结果差异逐步增大，但锌的线2在分析浓度范围内与线4基本贴合，差异幅度变化很小。数据分析结果见表11。铜、锌回归系数与0都差异极显著，这代表2种方法的测定结果的线性关系很密切。此外，铜、锌回归系数与1之间假设检验均不显著、截距与0之间假设检验均不显著，说明对方法间差异的判定受样品浓度差异和基质差异而带来的干扰较小，即恒定系统误差和比例系统误差较小[27]，但这2种误差严格意义上不能归类于系统误差，因为回归方程的回归系数和截距对系统误差不敏感。

表11 回归系数、截距的t检验

图3 铜元素的线性回归方程

图4 锌元素的线性回归方程

2.5 讨论

TOST的等效标准的设定与Bland-Altman法一致性分析的应用依据需要方法使用者与业界各个相关方共同探讨，同时结合考虑法规层面的需求[28-29]。显著性检验在否定无效假设时受检测方法精密度的影响而易犯一类错误，在接受无效假设时受样本量不足、方差过大的影响而易犯二类错误，而TOST的无效假设和备择假设与经典显著性假设的位置相反，显著水平为一尾概率，能够降低统计中犯一类错误的概率。故检测结果的评价应结合评价目的采用不同的统计手段进行处理。

“质控样检测比对”是在特定的检测条件下判断两检测方法间是否存在差异并界定等效的边界，但是未能对不同测试对象、不同检测浓度等条件存在情形下的方法间差异进行分析判定，而“样品检测比对”能综合考虑样品基质这种情况对分析结果的影响，能排除因配方奶粉类型的不同而带来的误差干扰，使分析结果更全面可靠。

国标FAAS法与ISO标准ICP-MS法在分析原理、方法定量方式和样品处理方式及其他细节参数上存在较大差异。根据方法比对结果，2种方法外部质控样检测结果均和真值接近，方法准确性均良好，精密度上ICP-MS方法相对更好，在10%等效标准范围和应用依据上方法均具有等效性和较好的一致性，方法可互相替代使用，但在5%等效标准范围和应用依据上方法均不具有等效性和一致性。对于有奶粉进出口业务的乳企而言，常规情况下这种差异应是可接受的，但当国内外质检结果有一定差异又临近标签值限值的极端情况下时，这种差异也可能会导致双边检测结果无法相互合规合法，故进出口乳企在面对这种差异时应引起重视。此外，ISO标准在奶粉样品的前处理上采用复溶方式进行样品制备，保障样品的均一性使检测结果具有更好的代表性，这也值得参考和借鉴。

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