田家齐，李苗云,2，朱瑶迪,2，赵莉君,2，刘世杰,2，刘惟佳，蒋 培，赵改名,2，徐丽娜,2，孙灵霞,2，马阳阳,2，梁 栋,2

基于SERS技术的基底增强效应对比及食源性芽孢快速检测

田家齐1，李苗云1,2，朱瑶迪1,2※，赵莉君1,2，刘世杰1,2，刘惟佳1，蒋 培3，赵改名1,2，徐丽娜1,2，孙灵霞1,2，马阳阳1,2，梁 栋1,2

（1. 河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002；
2. 河南省肉品加工与安全国际联合实验室，郑州 450002；
3. 河南省市场监督管理局质检中心，郑州 450006）

为了实现食源性芽孢的快速识别，该研究利用表面增强拉曼光谱技术，以产气荚膜梭菌芽孢（.spores）、艰难梭菌芽孢（.spores）和生孢梭菌芽孢（.spores）为研究对象，将3种不同纳米溶胶材料AuNPs、AgNPs和Au@AgNPs作为表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）基底对食源性芽孢的增强效应进行对比，确定较佳增强效果的纳米材料，进一步开展基于较优纳米溶胶材料为基底的SERS技术对不同种属食源性芽孢的光谱解析及快速识别研究。结果表明，Au@AgNPs对食源性芽孢的SERS增强效果最较好，其增强因子达3.49×104，且光谱特异性和重现性良好。经拉曼光谱解析，Ca2+-DPA的拉曼峰是三种食源性芽孢的共有标志特征峰，拉曼振动峰在1 017、1 440和1 570 cm-1波段显示且峰强度不同。.芽孢在740、787、821、1 203、1 308和1 627 cm-1有独特的拉曼峰，.芽孢在852 cm-1有独特的拉曼峰，在1 017 cm-1（Ca2+-DPA）、1 081 cm-1（DNA、O-P-O）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，在1 332 cm-1（核酸中腺嘌呤核酸）、1 440 cm-1（Ca2+-DPA）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，3种食源性芽孢的SERS图谱出峰位置和峰强度差异明显。结合主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）构建定性识别模型，经 PCA分析，其前三个主成分的累计贡献率达92.90%，然后利用LDA进行分析，其识别率可达到100%。结果表明，以Au@AgNPs为基底的SERS技术检测方法可以实现对食源性芽孢的快速识别，为食源性芽孢检测和食品安全检测提供了有效手段。

光谱分析；
模型；
表面增强拉曼光谱（SERS）；
溶胶纳米材料；
食源性芽孢；
快速识别

食源性芽孢是部分食源性致病菌在不利条件下为了存活产生的休眠体，由于其特有的结构特点，赋予其极强的抗逆性。食源性芽孢经高温高压灭菌后仍能存活，当外界环境适宜时芽孢再次萌发形成菌体，生长繁殖过程中产生毒素，引起食品腐烂变质甚至食源性疾病[1]。每年由于食源性致病菌导致的食源性疾病造成全球约2 000万人死亡，对食品质量安全存在极大的威胁[2]。因此，开发快速灵敏、重现性高且及时有效的检测技术是预防和控制食源性芽孢的关键，也是世界公共卫生安全亟待解决的难题，对提高食品质量安全、减少食物中毒和食源性疾病的发生具有重要意义。

目前，芽孢的主要检测手段是平板培养法，结合营养萌发因子或非营养萌发因子各种诱导手段促使芽孢萌发为营养细胞，进而通过平板计数和16S rDNA鉴定来间接检测样本中芽孢污染情况[3]。虽然结果较为准确，但是培养、分离和鉴定过程费时耗力，检测时效性差。近年来，随着光谱检测技术的发展，方便快捷的光谱检测技术越来越多的应用于食品微生物检测。例如，荧光光谱技术，通过检测样本所发出的荧光光谱或强度来测定样品中的荧光物质和含量，具有简便快捷，重现性好，选择性高等优点，但缺乏化学结构信息的特异性，易受元素相互干扰和重叠峰的影响，难于分析[4]；
近红外光谱技术主要是通过使用含氢基团，有效获取样本光谱中所包含的物理信息、化学信息或生物信息，具有快捷无损，易操作和成本低等优点，但不适用于水分含量大的样本检测，灵敏度低[5]。这些方法对食源性芽孢的检测都存在难以避免的局限性。拉曼光谱作为分子的振动光谱，受水分干扰小，适用于生物样本的检测，但存在检测信号弱的缺点[6]。表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）技术通过贵金属纳米材料与待测物偶联吸附，通过电磁增强效应使待测物的拉曼散射信号强度放大，以增强拉曼信号[7]。SERS作为一种生物指纹识别技术，不需对样品过多前处理，具有简单、高效、灵敏等优势，可满足对食源性芽孢快速检测的需求[8]。

国内外许多研究表明，SERS技术在食源性致病菌快速检测领域具有巨大的优势和发展潜力。Xu等[9]设计了一种通过将金属掺杂的沸石咪唑酯骨架（ZIF-67）及其衍生物锚定到棉织物为SERS基底，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行SERS光谱解析及定性定量识别，该基底表现出6.07×106的高增强因子和10-8mol/L的低检测限。Bozkurt等[10]通过开发ALP酶固定化纳米颗粒SERS生物传感器，用于大肠杆菌的特异性识别和快速检测，大肠杆菌浓度为1.7×101～1.7×106cfu/mL时建立了良好的线性关系（2= 0.992）。Chen等[11]采用无标记表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）检测饮用水中致病菌的方法，在细菌悬浮液中合成银纳米溶胶，该方法可以选择性地区分不同的细菌种类，鉴别出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和李斯特菌等几种常见病原菌，区分了两种李斯特菌，整个分析在5 min内完成，试验的检测限为103cfu/mL。Hayleigh Kearns等[12]将具有细菌特异性识别分子的SERS活性银纳米颗粒与凝集素功能化的磁性纳米颗粒相结合，从而能够通过磁分离捕获和分离实现对大肠杆菌、伤寒杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的单一病原体的快速检测，每种菌株的最低检测浓度仅为10 cfu/mL。然而，基于SERS技术对不同食源性芽孢的光谱解析和快速识别鲜见报道。

基于此，本研究通过制备三种不同溶胶纳米材料，纳米金溶胶AuNPs、纳米银溶胶AgNPs以及金属复合纳米粒子Au@AgNPs作为SERS基底材料，以产气荚膜梭菌芽孢（.spores）、艰难梭菌芽孢（.spores）和生孢梭菌芽孢（.spores）为研究对象，通过对比3种不同溶胶纳米与.spores的增强效应对比，确定食源性芽孢SERS检测最佳基底材料。进一步，以增强效应最佳的溶胶材料作为SERS基底，采集3种不同食源性芽孢的SERS图谱并进行解析，结合主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）实现食源性致病菌芽孢的快速识别，为快速、便捷地检测食源性致病菌芽孢提供有效手段。

1.1 试剂与材料

菌株.ATCC 13124、.ATCC 43593、.BNCC 185933，来自中国菌种保藏中心和广东环凯微生物技术有限公司，-80 ℃保存于瓷珠法菌种保存管中。胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（Tryptose Sulfite Cycloserine Agar Base，TSC），产芽孢肉汤，购于北京陆桥有限公司；
强化梭菌培养基（Reinforced Clostridium Medium，RCM），硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium，FTG），脑心浸液肉汤（Brain Heart Infusion Broth，BHI），营养琼脂（Nutrient Agar，NA），购于青岛海博有限公司；
酵母提取物，L-半胱氨酸，牛磺胆酸钠，柠檬酸钠溶液，氯化钠（NaCl），抗坏血酸，等购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

超纯水机OSJ-UP-30L，济南欧莱博科学仪器有限公司；
低温培养箱MIR-254，日本SANYO公司；
生物安全柜OSJ-UP-30L，上海川一实验仪器有限公司；
高速冷冻离心机ALLEGRA-64A，美国Beckman Coulter公司；
蒸汽压力灭菌锅HVE-50，日本HIRAYAMA公司；
生物显微镜ECLIPSE 80i，日本NIKON公司；
紫外分光光度计UV-2600，岛津企业管理（中国）有限公司；
纳米激光粒度仪Winner 802，济南微纳颗粒仪器股份有限公司；
激光共聚焦拉曼仪LabRAM HR Evolution，HORIBA上海茂培科技有限公司。

1.3 食源性致病菌芽孢的培养方法

1）产气荚膜梭菌芽孢的制备。将-80℃瓷珠法菌种保存管中的.s瓷珠取出，分区划线接种于TSC培养基，37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h。用接种环挑取培养基中的单菌落转移到FTG中，37℃厌氧培养12 h。将增菌液转移到产芽孢肉汤中，37℃恒温厌氧培养48 h。取培养液于离心管中，离心（8 000 r/min、10 min、4 ℃）取沉淀物，加入灭菌的去离子水离心洗涤3～7次。将离心后的芽孢沉淀重悬去离子水中，将浓度调整为107cfu/mL后保存至-20 ℃直至使用。

2）艰难梭菌芽孢的制备。将-80℃瓷珠法菌种保存管中的.瓷珠取出，分区划线接种于FTG培养基，37 ℃厌氧培养24～48 h。挑取单菌落接种到已加入促芽孢生长因子（1%酵母提取物、0.1% L-半胱氨酸和0.05%牛磺胆酸钠）的BHI肉汤中，37 ℃厌氧培养5～7 d。离心、镜检与保存方法同上。

3）生孢梭菌芽孢的制备。将-80 ℃瓷珠法菌种保存管中的.瓷珠取出，分区划线接种于RCM培养基，37 ℃培养12～24 h。挑取单菌落接种到RCM液体培养基中增菌，37 ℃培养24 h。将增菌液转移到RCM固体培养基中，37 ℃恒温培养6～7 d。用经过灭菌的载玻片将芽孢从RCM培养基中刮下，离心、镜检与保存方法同上。

1.4 不同种类纳米材料的制备

1）AuNPs溶胶的制备。以柠檬酸钠还原法制备AuNPs溶胶的方法为基础稍作修改[13]。向100 mL超纯水中加入0.01 g HAuCl4搅匀，加热沸腾后，在磁力搅拌下，滴加1.5 mL、1%的柠檬酸钠溶液，待颜色变为酒红色后继续加热15 min。制得AuNPs溶胶，在4 ℃避光保存备用。

2）AgNPs溶胶的制备。按照抗坏血酸氧化还原法制备AgNPs溶胶方法稍作修改[14]。向20 mL超纯水中加入5 mL聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVP），用磁力搅拌器搅拌的同时加入85 mL AgNO3。在磁力搅拌下，加入200L、5 mol/L NaCl溶液，制得AgCl胶体，避光备用。取0.5 mol/L的NaOH溶液，在快速搅拌下向其中滴加20 mL、50 mmol/L抗坏血酸溶液，并加入2.3 mL的新制AgCl胶体，避光下搅拌2 h，得到呈灰绿色的AgNPs溶胶，4 ℃保存备用。

3）Au@AgNPs溶胶的制备。改进汪崇文[15]的方法来合成Au@AgNPs溶胶。向锥形瓶中加入100 mL超纯水和0.01 g的HAuCl4溶液，用电磁加热搅拌器加热至沸腾（600 r/min），向其中滴加6 mL、1 %的柠檬酸钠溶液，继续加热10 min，制得AuNPs溶胶溶液，作为银壳包覆的种子。取150 mL超纯水加入上述制备的50 mL AuNPs溶胶溶液和2 mL、1%柠檬酸钠，用电磁加热搅拌器加热至沸腾（600 r/min）。向上述煮沸的溶液中滴加1 mL、0.2% AgNO3溶液，30 min后停止加热，待溶液冷却至室温后用超纯水定容至200 mL，所得为Au@AgNPs溶胶溶液。

1.5 纳米材料的表征

参考Song等[16]的方法，对制备的3种不同种类纳米材料进行紫外可见分光光度计（UV-Visible Spectrophotometer，UV-Vis）、透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）和粒度分布进行表征。

1.6 样品的制备

将培养所得的不同芽孢液和纳米溶胶分别离心三次后重悬备用。将浓度均为107cfu/mL离心后的.芽孢、.芽孢、.芽孢溶液分别与AgNPs、AuNPs、Au@AgNPs溶胶按1∶1混合，超声震荡5 min，使三种纳米溶胶分别与三种芽孢混合吸附，分别将待测样品于载玻片上，并将AgNPs和3种芽孢分别在载玻片上做空白对照，放置在无菌操作台中自然晾干备用。试验中所用的载玻片用王水（VHCl∶VHNO3=3∶1）浸泡清洗，去除其表面的杂质，之后用超纯水洗涤三遍，用氮气吹干载玻片，备用。

1.7 拉曼光谱检测

开启LabSpec 6.0软件，用硅片（Si）做空白，以520.77 cm-1峰作为基准峰校零。表面增强拉曼光谱采集使用532.8 cm-1的激光作为激发光源，设置强度为最大强度（15 mW），物镜为100倍，积分时间30 s，积分3次。检测的光谱为400～3 200 cm-1，分辨率为1 cm-1。将处理好的样品进行上机检测，之后使用LabSpec 6.0软件对样品进行光谱采集，对每个样品分别随机采集10次。

为量化纳米材料的SERS增强效应，可通过式（1）[17]计算SERS增强因子（Analytical Enhancement Factor，AEF），式中I为芽孢在未使用增强基底条件下的拉曼特征峰峰强度（a.u.）；
C为芽孢在未使用增强基底条件下的浓度（cfu/mL）；
I为芽孢在使用增强基底条件下的拉曼特征峰峰强度（a.u.）；
C为芽孢在使用增强基底条件下的浓度（cfu/mL）。

1.8 数据分析

使用EXCEL 2010、SPSS 16.0数据分析软件、Origin 2021软件进行数据处理。

2.1 材料的表征结果

2.1.1 三种纳米材料的UV-Vis表征

由于不同金属纳米材料具有不同的表面等离子体耦合峰，可从紫外-可见吸收光谱中获得。不同纳米材料的紫外吸收峰位置、峰高、半峰宽分别与材料的种类、浓度、粒径分布有关[18]。用紫外-可见分光光度计对三种不同纳米材料表征结果如图1所示。抗坏血酸还原法制备的AgNPs，最大吸收峰在518 nm，由柠檬酸钠还原法制备的AuNPs，出峰位置在437 nm处。AgNPs和AuNPs的峰形具有一定的对称性，峰值相对尖锐、半峰宽相对较窄，说明制备的AgNPs和AuNPs尺寸分布较窄。图1中Au@AgNPs的紫外-可见吸收光谱相对于AuNPs的吸收光谱，Au@AgNPs的吸收光谱在420 nm处出现新的吸收峰，与纯AgNPs的SPR吸收峰接近，表明在Au核上形成了Ag壳[19]，成功制得Au@AgNPs溶胶。

图1 三种不同种类的纳米溶胶的UV-Vis表征

2.1.2 三种纳米材料的粒度分析和TEM表征

为进一步了解三种不同纳米材料的尺寸大小、形貌、分散性，对三种纳米材料进行TEM和粒度表征，结果如图2所示。由图2中a、d可知，改良柠檬酸钠还原法制备的AuNPs的粒径大小主要分布在30～150 nm之间，形貌呈圆球形颗粒，分散较集中；
如图2中b、e所示，改良抗坏血酸还原法制备的AgNPs的粒径大小主要分布在20～70 nm之间，形貌呈不规则球状，有少数圆三角形和正方形；
由图2中c、f可知，Au@AgNPs溶胶的粒径大小主要分布在35～85 nm之间，能明显观察到Au@AgNPs呈Au核Ag壳夹层结构，中间的金核呈球形，整体的Au@AgNPs呈不规则球状，进一步证明了Au@AgNPs的成功合成。AuNPs的粒径分布范围较宽，尺寸均匀度相对较差，而AgNPs和Au@AgNPs的粒径分布相对集中，尺寸均匀度相对较好。这对基底的SERS增强效应和信号重现性至关重要，为进一步SERS检测食源性芽孢奠定良好基础。使用Nano Measurer软件分别统计三种纳米材料的200颗纳米粒子的粒径，计算出三种纳米材料的平均粒径，其中AuNPs为82.26 nm，AgNPs为49.83 nm，Au@AgNPs为57.85 nm。

图2 三种纳米材料的粒径分布图和TEM表征图

2.2 不同纳米材料对芽孢SERS增强效应对比

为了解AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs三种溶胶纳米材料（NPs）的增强效果，以.芽孢为检测对象，使用激光共聚焦拉曼光谱仪分别对.芽孢和“.芽孢+NPs”混合样品进行光谱采集，.芽孢的拉曼光谱作为空白对照。如图3所示，为AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs对.芽孢增强效果和.芽孢未增强的拉曼光谱图，当仅有芽孢存在时，拉曼光谱信号弱，芽孢的拉曼光谱图未出现任何显著特征峰型，而当芽孢分别与3种纳米材料混合时，拉曼信号均有一定的增强，且芽孢的拉曼信号谱峰图出峰明显，“.芽孢+NPs”的SERS图谱在1 017 cm-1、1 084 cm-1、1 570 cm-1的拉曼光谱有显著增强。以1 570 cm-1处拉曼光谱强度计算增强因子，结果如表1可知，AuNPs增强因子为1.69×104；
AgNPs增强因子为3.50×103；
Au@AgNPs增强因子为3.49×104；
Au@AgNPs增强因子远高于AuNPs和AgNPs，Au@AgNPs对食源性芽孢的SERS增强效果较佳。这可能与纳米材料的种类有关，作为复合纳米材料的Au@AgNPs对食源性芽孢的SERS增强效果要优于单一纳米材料对食源性芽孢的SERS增强效果[20]。

2.3 Au@AgNPs对三种芽孢的SERS增强效应重复性检验

良好的稳定性和重现性为基于SERS基底对食源性芽孢的快速识别结果提供了有力的可信度。为检验Au@AgNPs应用于食源性芽孢检测的稳定性，以浓度均为107cfu/mL的.芽孢、.芽孢、.芽孢为例，通过激光共聚焦拉曼光谱仪随机扫描10次。由图4所示，Au@AgNPs的10条平行SERS光谱的一致性较好，且.芽孢在1 570 cm-1的拉曼峰值相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为6.78%，.芽孢在1 570 cm-1的RSD为3.94%，.芽孢在1 570 cm-1的RSD为5.83%。结果表明，以Au@AgNPs为基底的SERS技术检测食源性芽孢具有较好的重现性。

图3 三种材料对C. perfringens芽孢的增强效果

表1 三种纳米材料的增强因子

注：I和C为未使用增强基底时1 570 cm-1左右的CaDPA特征峰的拉曼光谱强度和相对应的浓度，I和C为使用3种不同纳米溶胶作为增强基底时1 570 cm-1特征峰的拉曼光谱强度和相对应的浓度。由于芽孢未增强时拉曼信号微弱，因此未增强浓度为增强浓度的100倍以获得芽孢的原始拉曼图谱。

Note:IandCrefer to the Raman spectral intensity and corresponding concentration of the characteristic peak of CaDPA around 1 570 cm-1without the reinforced substrate, whileIand Crefer to the Raman spectral intensity and corresponding concentration of the characteristic peak of 1 570 cm-1with three different nanosols as the reinforced substrate. Because the Raman signal of spores is weak when they are not enhanced, the unenhanced concentration is 100 times of the enhanced concentration to obtain the original Raman spectrum of spores.

2.4 三种芽孢的光谱解析

通过相差显微镜观察产气荚膜梭菌芽孢（.spores）、艰难梭菌芽孢（.spores）和生孢梭菌芽孢（.spores），在100倍油镜下显示三种芽孢清晰可见且形态相似，均呈现中间发亮的椭圆状结构，表明三种芽孢的成功制备。利用SERS技术的指纹识别功能对三种芽孢进行拉曼信号放大和光谱信息采集，通过解析食源性芽孢的SERS光谱，探究不同芽孢之间的分子结构和异同之处，实现基于SERS技术对三种食源性芽孢的快速定性识别。

对三种不同食源性芽孢与Au@AgNP的复合物分别进行10次随机拉曼数据采集，经基线校正、归一化和平滑处理，对3种食源性致病菌芽孢的SERS平均指纹图谱和SERS光谱拉曼位移的暂定归属如图5和表2所示。结果如图5所示，经过Au@AgNP基底对三种食源性芽孢拉曼图谱的增强，三种芽孢的特征峰清楚且有明显差异。图5为.芽孢、.芽孢、.芽孢的SERS平均光谱。表2是对这三种芽孢的典型拉曼光谱峰进行了详细的暂定归属。由图5和表2可知，.芽孢有16处明显拉曼振动峰，分别在549、680、740、787、821、1 017、1 084、1 203、1 268、1 308、1 328、1 400、1 447、1 506、1 565和1 627 cm-1；
.芽孢有13处明显拉曼振动峰，分别在555、685、769、1 019、1 094、1 238、1 281、1 331、1 403、1 454、1 509、1 578和1 669 cm-1；
.芽孢有13处明显拉曼振动峰，分别在550、668、760、852、1 015、1 092、1 232、1 277、1 401、1 452、1 509、1 570和1 671 cm-1。这些拉曼特征峰分别归属于540 cm-1的蛋白质S-S键、661～674 cm-1的半胱氨酸C-S拉伸模式、761 cm-1的胞嘧啶和尿嘧啶、1 017 cm-1处为Ca2+-DPA、1 090 cm-1的DNA和O-P-O、1 235 cm-1的酰胺Ⅲ、1 270～1 280 cm-1范围内为酰胺Ⅲ和脂质CH2（变形）、1 322～1 339 cm-1为核酸中腺嘌呤核酸、1 395 cm-1和1 440 cm-1的Ca2+-DPA、1 501cm-1的N=H折叠和腺嘌呤、1 570 cm-1的Ca2+-DPA、1 669 cm-1为酰胺Ⅰ的不饱和脂质。

三种不同的芽孢具有自身独特的SERS峰位，不同的峰位归属于自身特有的化学键及振动形式。.芽孢在740 cm-1（细胞壁肽聚糖结构单元）、787 cm-1（酪氨酸C-N键拉伸振动）、821 cm-1（Ca2+-DPA）、1 203 cm-1（CH2延伸振动）、1 308 cm-1（酰胺Ⅲ）和1 627 cm-1（酰胺Ⅱ）波段显示特有拉曼峰；
.芽孢在852 cm-1（延伸CN酪氨酸；
糖苷键延伸C-C）位移处出现特有拉曼峰。

除此之外，三种食源性芽孢的SERS图谱在相同波段位置出峰的光谱峰相对强度显著不同，结果如图6所示。在1 017 cm-1（Ca2+-DPA）、1 081 cm-1（DNA、O-P-O）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，在1 332 cm-1（核酸中腺嘌呤核酸）、1 440 cm-1（Ca2+-DPA）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，三者两两之间峰位强度差距显著；
在1 570 cm-1（Ca2+-DPA）处.芽孢峰位强度远高于.芽孢和.芽孢两种芽孢，但.芽孢峰位强度略低于和.芽孢，差异不明显；
.芽孢在1 670 cm-1处峰位强度明显低于.芽孢和.芽孢，而后两种芽孢峰位强度没有明显差异。因此，拉曼谱峰特征有很大差异，可以明显区分，进一步结合主成分分析和判别分析法对不同种属的食源性芽孢进行鉴别分析。

图5 三种食源性芽孢在400～1 800 cm-1光谱波段的SERS光谱及相差显微镜镜检图

表2 三种芽孢SERS谱峰的暂定归属[18,21-25]

2.5 三种芽孢的SERS定性分析

为了更好实现不同食源性芽孢的定性识别，在400～1 800 cm-1的光谱波段范围内，采用PCA和LDA对食源性芽孢样本SERS图谱进行分析。运用PCA分析方法，将复杂的光谱数据转化为三维散点图，以便直观的观察出相似光谱之间的细小差异，用以判别不同种类间的关系[26]。对.芽孢、.芽孢、.芽孢各10个样本进行PCA分析，评估基于Au@AgNPs SERS基底采集的三种食源性芽孢拉曼图谱之间的差异性。其分析结果如图7所示。由图7可知，PCA分析可以很明显地将3种芽孢聚集成3个独立的簇，每个簇独立无重复，每种芽孢都能彼此区分开。PC1的方差贡献率为76.04%，PC2的方差贡献率为11.67%，PC3的方差贡献率为5.19%，累计贡献率达92.90%，基本代表了全部光谱信息。

图6 三种食源性芽孢SERS图谱中相同出峰位置的峰强度对比

图7 三种芽孢SERS图谱主成分分析的三维散点图

为了使三种芽孢分类效果更加理想，采用LDA对三种不同的芽孢进行区分。由图8可知，LDA完全区分了三种食源性芽孢的SERS光谱，每种芽孢的所有样本都集中在质心点附近的一个相对较小区域内，各区域间没有交叉重叠，具有较好的灵敏性和特异性，识别率达到100%。留一法交叉验证的将每一个样本作为测试样本，此方法主要用于样本量少的情况，样本量少于50时，一般采用留一交叉验证，于是将采集到的3种食源性芽孢样品的30条SERS光谱（每条光谱是积分3次得到的结果）通过“留一法”对判别模型进行交叉验证[27-28]，验证灵敏度和特异度均为100%。与PCA相比，LDA考虑了不同样品的类别信息，能使同种食源性芽孢样品间的差异最小化，使不同食源芽孢样品间的差异最大化。上述结果表明，结合PCA和LDA统计分析方法，可以实现对不同食源性芽孢的快速识别，为SERS定性识别食源性芽孢提供技术支持。

注：1、2、3分别为产气荚膜梭菌芽孢、艰难梭菌芽孢和生孢梭菌芽孢。

表3 三种食源性芽孢SERS光谱LDA模型的准确度

注：a表示未经交叉验证的灵敏度和特异度；
b代表交叉验证下的灵敏度和特异度。

Note: a indicates the sensitivity and specificity without cross-validation; b represents the sensitivity and specificity under cross-validation.

1）本研究基于表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）技术快速识别不同食源性芽孢，首先制备合成AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs三种不同的溶胶纳米材料，并对其进行了紫外可见分光光度计（UV-Visible Spectrophotometer，UV-Vis）、透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）和粒度分布进行表征，确定形貌特性。

2）将三种纳米材料与食源性芽孢（.spores、.spores和.spores）偶联，采集拉曼指纹图谱，对比三种纳米材料增强效果，Au@AgNPs对食源性芽孢的SERS增强效果最好，其增强因子达3.49×104，且光谱特异性和重现性良好。

3）分析了食源性芽孢的SERS图谱差异性和重现性，结合化学计量学法构建快速识别模型，实现不同种属食源性芽孢的快速识别。Ca2+-DPA的是三种食源性芽孢的共有标志特征峰，拉曼振动峰在1 017、1 440和1 570 cm-1波段显示且峰强度不同。.芽孢在740、787、821、1 203、1 308和1 627 cm-1有独特的拉曼峰，.芽孢在852 cm-1有独特的拉曼峰，在1 017 cm-1（Ca2+-DPA）、1 081 cm-1（DNA、O-P-O）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，在1 332 cm-1（核酸中腺嘌呤核酸）、1 440 cm-1（Ca2+-DPA）处峰位强度.芽孢>.芽孢>.芽孢，三种食源性芽孢的SERS图谱出峰位置和峰强度差异明显。结合主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）构建定性识别模型，PCA前三个主成分的累计贡献率达92.90%，LDA的识别率达到100%，说明以Au@AgNPs为基底的SERS技术检测方法可以实现对食源性芽孢的快速识别，为食源性芽孢检测和食品安全检测提供了有效手段。

SERS技术具有高灵敏、干扰小和快速无损检测等优点，在生化检测及现场快速检测方面有巨大优势，在食源性致病菌快速鉴别方面具有广阔的应用潜力和前景。尽管如此，SERS技术在食源性致病菌检测中的实际应用依然面临很大挑战，大多数研究并没有聚焦于实际样品，食品中复杂的组成成分对检测产生极大的干扰，给SERS技术在实际食品样品中的微生物检测应用带来一定困难。如何避免去除实际应用中食品复杂组成成分的干扰，如何实现食品样品中目标检测微生物的分离富集和靶向捕获等问题是SERS技术实际应用中需要突破的研究难点和研究热点。因此，开发制备适用于不同检测条件需求的SERS活性基底材料，将SERS技术与微流控、薄层层析（Thin-Layer Chromatography，TLC）和固相微萃取（Solid-Phase Microextraction，SPME）等技术手段融合，以期实现SERS技术在复杂环境背景下的实际应用。

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Enhanced performance comparison of substrate materials and rapid detection of foodborne bacterial spores based on SERS

Tian Jiaqi1, Li Miaoyun1,2, Zhu Yaodi1,2※, Zhao Lijun1,2, Liu Shijie1,2, Liu Weijia1, Jiang Pei3, Zhao Gaiming1,2, Xu Lina1,2, Sun Lingxia1,2, Ma Yangyang1,2, Liang Dong1,2

(1.,450002,;2.,450002,;3.,450006,)

The spores of foodborne pathogens are hardly eradicated in the food industry, due to the extreme resistance. The potential risks to food safety have been from the serious foodborne diseases upon germinating and infecting. Taking three common pathogenic,andspores as the research objects, rapid identification was proposed using Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). A comparison was made on the enhancing ability of three noble-metal colloids substrate of AuNPs, AgNPs, and Au@AgNPs. An optimal SERS substrate material was then achieved to rapidly identify the fingerprints of foodborne spores. Three noble metal nanoparticle colloids SERS substrates were fabricated via hydrothermal reduction. The irregular spherical structure was obtained with an average size of 82.26 nm AuNPs, 49.83 nm AgNPs, and 57.85 nm Au@AgNPs. Notably, the structure of Au core and Ag shell indicated the successful preparation of Au@AgNPs. The uniform AgNPs and Au@AgNPs with the nano-scale distribution were superior to the AuNPs. Particularly, the homogeneous nanostructure provided a solid foundation for excellent SERS performance and signal reproducibility. The nanoparticle morphologies were characterized by a field-emission scanning electron microscope. The prominent characteristic peaks were selected in the spectra of spores for further analysis of enhancement performance. Among them, the Ca2+-DPA was known as the biomarker for the inner core of spores. The results showed that the optimal SERS performance of Au@AgNPs was achieved to detect the foodborne pathogenic spores with an analytical enhancement factor (AEF) of 3.49×104, indicating excellent spectroscopic specificity and signal reproducibility. According to the Raman shift and characteristic peaks, the characteristic peaks of Ca2+-DPA around 1 017, 1 440, and 1 570 cm-1were the common specific peaks but with different intensities. Specifically, thespores presented the specific characteristic peaks at around 740, 787, 821, 1 203, 1 308, and 1 627 cm-1, whereas, the specific characteristic peaks at 852 cm-1were found in thespores. The intensities of characteristic peaks at 1 017 cm-1(Ca2+-DPA), and 1 081 cm-1(DNA, O-P-O) were ranked in the order of the>>spores. However, the intensity at around 1332 cm-1(adenine nucleic acid in nucleic acid) and 1 440 cm-1(Ca2+-DPA) ofspores was stronger than that ofspores, but lower than that ofspores, indicating the remarkable differences of Raman shifts and intensity in SERS spectra of three spores. A qualitative identification and discrimination model was established to combine the SERS spectra of three spores with the multivariate statistical analysis (PCA and LDA). The PCA demonstrated that the accumulated variance contribution rate for the top three principal components was up to 92.90%, and the recognition rate of LDA analysis reached 100%, fully meeting the specificity and sensitivity. The SERS performances of three noble-metal nanoparticles substrates were utilized to analyze the fingerprints spectra of three spores using SERS and multivariate statistical analysis. A rapid and accurate performance was achieved in the classification and identification of the different strains, indicating the favorable purpose of detection. An effective and reliable risk detection can be expected to serve as the food safety control and rapid identification of microorganisms as a bio-sensor platform. The finding can provide a strong reference for safety control in the subsequent food processing.

spectral analysis; models; Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS); colloid nanomaterials; food-borne spores; rapid identification

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.20.029

O657.3

A

1002-6819(2022)-20-0257-09

田家齐，李苗云，朱瑶迪，等. 基于SERS技术的基底增强效应对比及食源性芽孢快速检测[J]. 农业工程学报，2022，38(20)：257-265.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.20.029 http://www.tcsae.org

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2022-06-07

2022-10-01

河南省杰青项目（212300410008）；
河南省高等学校重点科研项目（22A550013）；
河南省高校科技创新团队支持计划项目（22IRTSTHN021）；
河南省科技攻关项目（212102110081，212102110334）；
河南省市场监管管理局科技计划项目（2022sj81）；
小麦玉米作物国家重点实验室开放课题项目（30501006）

田家齐，硕士，研究方向为肉类加工与质量控制。Email：tianjiaqi1023@163.com

朱瑶迪，博士，副教授，研究方向为食品无损检测。Email：zhu_yaodi@163.com

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