景永帅，孙丽丛，张瑞娟，代立霞，李兰，张丹参，吴兰芳，国旭丹*

（1.河北科技大学 化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；
2.石家庄市中医院肛肠科，河北 石家庄 050051；
3.河北中医学院 药学院，河北 石家庄 050200）

玉竹为百合科植物玉竹 [Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的干燥根茎[1]，最早记载于《神农本草经》中，是常用的药食两用资源，具有生津止燥、养阴清咳等功效，其富含多糖、黄酮、生物碱和强心苷等物质[2]。玉竹多糖作为其主要的活性成分之一，具有抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]、调节血脂[6]等作用。

近年来，越来越多的研究表明，多数非淀粉植物多糖不能完全被消化道降解，进而到达结肠，被肠道微生物发酵利用，并且产生酸性代谢产物调节机体代谢[7]。但也有数据表明，人体消化液对于多糖的结构依旧存在一定的影响，可部分降解多糖[8]。故探究多糖在消化过程中的结构变化和对机体的作用方式显得尤为重要。消化试验最好方式是直接在生物体内进行，但由于消化系统的复杂性及试验成本等方面原因，大多数情况都是选择体外试验模拟体内消化的方式进行，体外模拟已成为模拟人体内消化吸收过程的有效途径和趋势[7]。近年来，对玉竹多糖的研究主要集中在提取工艺优化、分离纯化、单糖组成及药理活性等方面，而对玉竹多糖在体内外消化和酵解的研究鲜见。

本研究旨在运用体外模拟消化系统和肠道微生物模型探究玉竹多糖消化过程中的变化，探究玉竹多糖发挥功能特征的作用机理，为相关产品的开发和利用提供理论依据。

1.1 材料与仪器

玉竹：安国墨源中药材公司，经河北中医学院药学院郑玉光教授鉴定为百合科植物玉竹[Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的根茎；
甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
胰蛋白酶（200 U/mg）、脂肪酶（200 U/mg），胃蛋白酶（500 U/mg）、α-淀粉酶（1 000 U/mg）：分析纯，深圳市振芯嘉贸易有限公司；
牛肉浸膏、硫酸铵，硫酸锰（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2电热恒温水浴锅：江苏金坛宏华仪器厂；
752紫外可见分光光度仪：上海光谱仪器有限公司；
ME204E/02电子秤：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
YXQ-SG46-280SA立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
TGL-15B高速离心机：上海安亭科学仪器厂；
S-100傅里叶变换红外光谱仪：德国珀金埃尔默公司；
LC1220高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；
THZ台式恒温振荡器：常州普天仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉竹多糖的提取

取玉竹，粉碎，过30目筛，25倍无水乙醇冷浸24h，除去脂溶性成分，抽滤后，药渣通风处干燥，干燥后密封保存，备用。干燥粉末按固液比1:50（g/mL）加入蒸馏水，85℃水浴提取3 h，提取2次，合并液滤，浓缩至滤液体积1/4，用5倍体积的无水乙醇醇沉，静置过夜，抽滤，回收沉淀，干燥后即得玉竹粗多糖。

1.3.2 体外模拟唾液消化

模拟唾液：根据文献[9]配制模拟唾液消化液，称取α-淀粉酶0.215 5 g加入到250 mL唾液电解质（pH值为6.9）中溶解，磁力搅拌20 min后过滤，滤液中再加入250 mL的唾液电解质溶液混匀，放置冰箱备用。取30 mL玉竹多糖溶液和30 mL模拟唾液、30 mL水和30 mL模拟唾液、30 mL多糖溶液和30 mL水的混合物分别加入锥形瓶中。所有锥形瓶在37℃水浴锅中进行反应，在消化过程中（0.5 h），取出3 mL混合物，浸入沸水浴中使唾液酶失活后分别进行还原糖含量、分子质量和游离单糖组成及含量的测定。

1.3.3 体外模拟胃液消化

模拟胃液：根据文献[9]配制模拟胃液消化液，称取150 g胃电解质溶液，向其中加入35.4 mg胃蛋白酶、37.5 mg胃脂肪酶以及1.5 mL CH3COONa（pH值为5.0、1.0 mol/L），在室温下磁力搅拌10 min用0.1 mol/L盐酸溶液将pH值调至1.5，置于冰箱备用。取30 mL水和30 mL模拟胃液、30 mL多糖溶液和30 mL模拟胃液的混合物分别加入锥形瓶中。所有锥形瓶在37℃台式恒温振荡器（150 r/min）中进行反应，在消化过程中（0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胃蛋白酶失活后分别测定还原糖含量、分子质量和游离单糖的组成及含量。

1.3.4 体外模拟胃肠消化

模拟肠液：根据文献[9]配制模拟肠液消化液，称取26 mg的胰蛋白酶放置于棕色瓶中，向其中加入100 g胰酶溶液，200 g胆汁以及100 g肠电解质溶液（simulated intestinal electrolyte solution，SIE），最后用 0.1 mol/L的NaOH把pH值调至7.5，置于冰箱中备用。取30 mL模拟胃液和30 mL水、30 mL模拟胃液和30 mL多糖溶液以及30 mL水和30 mL多糖溶液分别加入锥形瓶中，在37℃台式恒温振荡器（150 r/min）中反应6.0 h后，再向锥形瓶中分别加入30 mL模拟肠液，在消化过程中（0.5、1.0、2.0、4.0 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胰蛋白酶失活后分别测定还原糖含量、分子质量和游离单糖的组成及含量。

1.3.5 玉竹多糖对肠道菌群调节作用

1.3.5.1 培养基

MRS培养基：10.0 g蛋白胨，5.0 g牛肉膏，4.0 g酵母提取物，2.0 g柠檬酸氢二铵，20.0 g葡萄糖，2.0 g磷酸氢二钾，1.6 g硫酸铵，5.0 g乙酸铵，0.2 g硫酸镁，0.05 g硫酸锰，1 mL吐温80，去离子水1 000 mL，混匀后保存于4℃下备用。

LB培养基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母，10.0 g氯化钠，去离子水1 000 mL，混匀后保存于4℃下备用。

1.3.5.2 菌种活化及生长曲线的测定

将大肠杆菌（大肠埃希氏菌，CGMCC NO.1.1521）和乳杆菌（植物乳杆菌，CGMCC NO.1258）以0.1%接菌量分别接种于LB培养基和MRS培养基上，37℃恒温厌氧培养48 h进行菌种活化。在体积100 mL的液体试验培养基中分别加入10 mL的0.2 mg/mL的玉竹多糖，并均接种2%的大肠杆菌和乳杆菌菌悬液，37℃下静止培养，采用比浊法在不同时间间隔（0、0.5、2、4、6、8、16、24、40 h）测定大肠杆菌、乳杆菌的生长曲线，用紫外可见分光光度计在560 nm下测定OD值及pH值，以基础培养基为空白[10]。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。同时测定在0、0.5、1.0、2.0、4.0、12.0、24.0 h时的还原糖含量、分子质量和游离单糖组成。

1.3.6 化学成分分析

玉竹多糖的总糖含量测定采用以葡萄糖为标准的苯酚-硫酸法[11]；
玉竹多糖的蛋白质含量测定采用以牛血清蛋白为标准的考马斯亮蓝法[12]；
还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸法。

1.3.7 红外光谱扫描

采用KBr压片法，在4 000 cm-1～450 cm-1范围内对玉竹多糖进行红外光谱扫描[13]。

1.3.8 分子质量的测定

采用高效凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）对玉竹多糖及其消化后产物进行相对分子质量的测定。色谱条件如下：色 谱 柱 TSK-GEL G4000Pwxl，TSK-GEL G2500 Pwxl（10μm）；
流动相为超纯水，流速0.6mL/min，柱温30℃，进样量20 μL。各葡聚糖标准品配制成浓度为1 mg/mL的溶液，按上述色谱条件分析，以保留时间为横坐标，分子质量的常用对数为纵坐标作图。根据保留时间和标准曲线（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），计算待测样品的相对分子质量[14]。

1.3.9 单糖组成的测定

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对玉竹多糖及消化后产物进行单糖测定。取甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和岩藻糖（fucose，Fuc）配制成 1 mg/mL的混合标样，取0.2 mL于离心管中，分别加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.2 mL，70℃水浴锅加热30 min。冷却后加入0.2 mL 0.3 mol/L的盐酸，加入1 mL氯仿进行萃取，离心。取上清液重复上述操作3次，稀释，定容[15]。色谱条件：流动相为0.1 mol/mL磷酸盐缓冲溶液（pH值为7.0）:乙腈（体积比为83:17），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，紫外检测波长245 nm，进样量为20 μL。

精密称定玉竹多糖20 mg，加入5 mL的2.0 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，110℃下加热水解6 h。取出，放冷，加入甲醇旋转蒸发仪减压除去TFA，加入2 mL蒸馏水溶解，即为玉竹多糖的水解液，水解液按上述单糖标品处理方式采用相同色谱条件进行分析。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 17.0处理和分析数据，使用Origin 8.0和Microsoft Excel 2003作图。

2.1 玉竹多糖的理化性质

2.1.1 玉竹多糖的可溶性总糖、蛋白质和还原糖含量

总糖含量标准曲线为y=12.392 0x+0.142 9（R2=0.992 0）；
蛋白质含量标准曲线为y=7.312 9x+0.703 5（R2=0.992 0），还原糖标准曲线为y=0.933 7x+0.173 5（R2=0.995 0）。经计算玉竹多糖可溶性总糖含量为77.74%，蛋白质含量为3.98%，未在玉竹多糖中检测到还原糖。

2.1.2 玉竹多糖红外光谱分析

玉竹多糖红外光谱结果如图1所示。

图1 玉竹多糖的红外光谱图Fig.1 Infrared spectrum of P.odoratum polysaccharides

由图1可知，3 400.55 cm-1附近具有光滑而宽的强吸收峰，此为羟基（O—H）的伸缩振动，2 935.17 cm-1处的吸收峰与甲基或亚甲基的C—H的伸缩振动有关，1 740 cm-1左右吸收峰为酯基（—COOR）中的伸缩振动且吸收较弱，1 644.02 cm-1为O—H弯曲振动吸收峰，1 247.45 cm-1为 C—O 吸收峰，1 375.28 cm-1为C—H内弯曲振动，1 024.75 cm-1为醇羟基的变角振动，805.24 cm-1处为α-型糖苷键产生的吸收峰。

2.1.3 玉竹多糖的相对分子质量

玉竹多糖分子质量测定结果如图2所示。

由图2可知，玉竹多糖有2种分子质量分布，依据标准曲线（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），计算出分子质量分别为 1.37×106、6.75×103Da。

图2 玉竹多糖的高效凝胶渗透色谱图Fig.2 HPGPC chromatogram of P.odoratum polysaccharide

2.1.4 玉竹多糖的单糖组成分析

玉竹多糖水解后产物的色谱结果如图3所示。

由图3可知，玉竹多糖的单糖由Man、GalA、Glc、Gal组成，比例为13.55:2.42:1.00:2.81。

图3 标准品及玉竹多糖的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of standard and P.odoratum polysaccharides

2.2 玉竹多糖的体外模拟消化试验

2.2.1 模拟唾液消化

α-淀粉酶是口腔唾液中最主要的蛋白质成分，能分解淀粉及其他碳水化合物的α-（1→4）糖苷键[16]。模拟唾液消化0.5 h后玉竹多糖还原糖、单糖组成、相对分子质量的变化如图4所示。

图4 玉竹多糖的体外模拟唾液消化试验结果Fig.4 Results of the in vitro simulated saliva digestion test of P.odoratum polysaccharide

由图4A可知，多糖和模拟唾液本身不含还原糖，经唾液消化后，吸光度并未发生明显变化，没有产生还原糖；
由图4B可以看出，多糖水溶液和模拟唾液不含游离单糖，消化后并没有产生游离的单糖；
由图4C可知，相对于多糖水溶液，经唾液消化后的多糖的分子质量分布并未发生变化。以上结果说明，玉竹多糖不能被模拟唾液消化，与鼠尾藻多糖体外模拟唾液消化试验结果一致[17-18]。

2.2.2 模拟胃液消化

模拟胃液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的还原糖、单糖组成、相对分子质量的变化如图5所示。

图5 玉竹多糖的体外模拟胃液消化试验结果Fig.5 Results of the in vitro simulated gastric juice digestion test of P.odoratum polysaccharide

由图5A可知，多糖和模拟胃液本身不含还原糖，经胃液消化后，吸光度并未发生明显变化，没有产生还原糖；
由图5B可以看出，多糖水溶液和模拟胃液不含游离单糖，消化后并没有产生游离的单糖；
由图5C可知，玉竹多糖有2种分子质量分布，模拟胃液有2种分子质量分布，经胃液消化后，相对于多糖溶液和模拟胃液的分子质量分布，多糖的分子质量分布并未发生变化；
以上结果说明玉竹多糖不能被模拟胃液消化，与桑葚多糖在模拟胃液消化的试验结果相一致。

2.2.3 模拟胃肠液消化

模拟胃肠液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的还原糖、单糖组成和相对分子质量的变化结果如图6所示。

图6 玉竹多糖的体外模拟胃肠液消化试验结果Fig.6 Results of the in vitro simulated gastrointestinal fluid digestion test of P.odoratum polysaccharide

由图6A可知，多糖和模拟胃肠液本身不含还原糖，经胃肠液消化后，虽然吸光度值有显著性变化，但是并没有产生还原糖；
由图6B可以看出，多糖水溶液不含游离单糖，模拟胃肠液含葡萄糖，经胃肠液消化后并没有产生新的游离单糖；
由图6C可知，与多糖溶液和模拟胃肠液分子质量分布对比，经胃肠液消化后，多糖的分子质量分布并未发生变化；
以上结果说明玉竹多糖不能被模拟胃肠液消化。

综上所述，经唾液、胃液、胃肠液消化后，多糖还原糖、单糖组成、分子质量均不发生变化，说明玉竹多糖在体外模拟胃肠液模型中不被消化。

2.3 玉竹多糖与肠道菌群的相互影响

2.3.1 玉竹多糖对乳杆菌的影响

玉竹多糖对乳杆菌的影响如图7所示。

图7 多糖对乳杆菌的影响Fig.7 Effect of polysaccharide on Lactobacillus bulgaricus

由图7A可以看出，与空白组相比，加入多糖后，乳杆菌的pH值变化不明显；
由图7B乳杆菌的生长曲线可以看出，在6 h后乳杆菌生长进入对数生长期，菌数加速分裂，迅速生长，生长至20 h后，菌种生长基本保持在恒定状态，乳杆菌的生长进入稳定期，与空白组相比，加入多糖后，OD560值大于空白组，说明玉竹多糖对乳杆菌生长可能存在促进作用。

乳杆菌降解多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h 后玉竹多糖中的还原糖、单糖组成和相对分子质量的变化结果如图8所示，由图8A可知，多糖降解12 h和24 h时，还原糖含量显著增加（p<0.05，p<0.01），说明乳杆菌可以降解多糖，产生了还原糖；
由图8B可以看出，玉竹多糖经乳杆菌作用后，在12 h和24 h时检测到甘露糖，说明乳杆菌可以降解多糖，进而被机体利用；
由图8C可知，与多糖溶液和乳杆菌分子质量分布对比，经乳杆菌作用后，在32 min出现新的峰，进一步说明乳杆菌可以降解多糖；
以上结果说明玉竹多糖可以被乳杆菌降解。

图8 玉竹多糖经乳杆菌降解试验结果Fig.8 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Lactobacillus bulgaricus

2.3.2 玉竹多糖对大肠杆菌的影响

玉竹多糖对大肠杆菌的影响结果如图9所示。

由图9A的pH值变化可以看出，与空白组相比，加入多糖后，大肠杆菌的pH值变化不明显；
由图9B大肠杆菌的生长曲线可以看出，在4 h后大肠杆菌生长进入对数生长期，生长至20 h后，生长进入稳定期，与空白组相比，加入多糖后，OD560值小于空白对照组，说明玉竹多糖对大肠杆菌生长存在抑制作用。

图9 玉竹多糖对大肠杆菌的影响Fig.9 Effect of P.odoratum polysaccharide on Escherichia coli

大肠杆菌降解玉竹多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h后其中的还原糖、单糖组成和相对分子质量的变化结果如图10所示。

由图10A可知，多糖降解4 h和12 h时，还原糖含量显著增加，说明大肠杆菌可以降解多糖，产生了还原糖；
由图10B可以看出，玉竹多糖经大肠杆菌作用后，在4 h和12 h时检测到甘露糖，这与图8A结果一致。24 h时，甘露糖的峰消失，说明大肠杆菌可以降解多糖，进而被机体利用，并且降解的多糖可能作为碳源再次被大肠杆菌利用；
由图10C可以看出，与玉竹多糖和大肠杆菌的分子质量分布相比，玉竹多糖经大肠杆菌作用后，出现了新的峰，进一步说明大肠杆菌可降解玉竹多糖。龚雯等[19]在对金茶花多糖的体外消化及酵解特性研究中发现，金茶花多糖未被体外模拟胃肠道试验消化，但能被大肠杆菌等分解利用，与本研究的结果类似。

图10 玉竹多糖经大肠杆菌降解试验结果Fig.10 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Escherichia coli

综上所述，玉竹多糖对乳杆菌的生长有促进作用，可抑制大肠杆菌的生长，并且乳杆菌和大肠杆菌可部分降解多糖。

玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，含有2种分子质量分布，分别为1.37×106、6.75×103Da。在体外模拟消化系统中，经唾液、胃液和胃肠液消化后，发现多糖分子质量没有变化，而且消化前后的还原糖含量无显著变化，说明其均不能消化分解玉竹多糖。但是在乳杆菌和大肠杆菌的作用下，玉竹多糖在开始反应时均无单糖生成，随着时间的变化产生甘露糖，多糖分子质量降低，结果表明乳杆菌和大肠杆菌均能部分降解玉竹多糖。两者不同的是大肠杆菌在分解玉竹多糖后产生的甘露糖能够被机体再次吸收利用，而乳杆菌则不能；
玉竹多糖存在与否对乳杆菌的对数生长期无明显影响，但对乳杆菌的生长起到促进作用，而添加玉竹多糖能延长大肠杆菌对数生长期，但总体上对其增长起到抑制作用。综上所述，玉竹多糖在体外模拟胃肠道模型中不被消化，但在体外模拟菌种进行消化时能够被消化，并进一步被机体利用。

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