方子晗 喻祖豪 刘 颖 杨 振 王 可

1 湖北文理学院基础医学院预防医学教研室(襄阳 441053)

2 湖北文理学院临床循证与转化医学中心(襄阳 441053)

3 广州市第一人民医院(广州 510180)

肺癌是目前全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，且其对人类生命安全的威胁正在逐渐升高[1- 2]。虽然目前肺癌的诊疗手段有所改善，但肺癌病人的预后情况仍不太理想，其五年生存率不足30%[3]。因此，寻找肺癌相关个体化生物标志物，对肺癌的靶向治疗及预后状况改善具有十分重要的作用。相关结论表明，基因调控在肺癌的发展进程中至关重要[4- 5]。ABCC2(ATP binding cassette subfamily C member 2)编码蛋白作为ABC转运家族的重要构成部分，可通过细胞膜外和细胞膜内运输各种分子[6- 7]。研究显示ABCC2基因异常表达可参与多药耐药，与多种肿瘤细胞的耐药性显著相关[8- 9]。但目前关于ABCC2与肺癌预后之间相关性研究较少，且作用机制尚不明确。因此，本研究采用癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中的肺腺癌数据，分析ABCC2的基因表达情况，评估ABCC2在肺腺癌病人中的表达情况及其与病人预后之间的关联性。同时进行基因集富集分析，确定肺腺癌中与ABCC2调控相关的信号通路，初步探讨ABCC2对肺腺癌的发生发展产生作用的生物学机制。

1.1 TCGA

肺腺癌病人信息来自于TCGA数据库(截至2021年12月)，均从官网获得(https://portal.gdc.cancer.gov/)。数据下载格式为TPM，类型为RNA测序数据(RNAseq)和肺腺癌病人临床数据，包括ABCC2 mRNA表达数据，肺腺癌病人年龄、性别、种族、吸烟史、临床病理特征、随访结局等变量信息。经过初步数据清洗和合并，共有535例肺腺癌病人含有RNA测序数据及基本临床数据，57例肺腺癌病人同时具有癌组织和癌旁组织RNA测序数据。

1.2 HPA数据库

采用人类蛋白质图谱(human protein atlas，HPA)数据库(https://www.proteinatlas.org/)分析肺腺癌病人中ABCC2的蛋白水平情况[10]。选取数据库中正常肺组织和肺腺癌病人肿瘤组织的免疫组化结果进行对比分析，要求选取对象的性别相同，年龄相近，进行免疫组化检测时抗体型号一致。

1.3 基因功能富集性分析

基因富集分析(gene-set enrichment analysis，GSEA)用于评估并确定肺腺癌中与ABCC2调控相关的信号通路[11]。GSEA通过基因在癌组织和癌旁组织中表达的差异程度对基因进行排序，从而评估基因集是否能够进行富集。为探讨ABCC2过表达影响肺腺癌病人疾病发展的潜在生物学机制，将在肿瘤组织和癌旁组织中显著差异性表达基因设定为基因集，进一步以ABCC2作为表型标记基因，通过c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt进行富集分析。标准化处理后P< 0.05的基因集定义为显著富集。GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于相关基因集的富集性分析。

1.4 统计分析方法

2.1 肺腺癌病人基本临床特征

TCGA数据库中共有535例肺腺癌病人同时含有RNA测序数据和相关临床信息，基本描述见表1。肺腺癌病人中年龄大于65岁占总人数的50.6%，女性占比46.5%。病理分期为Ⅰ期的病人共294例，占比55.8%。T1期病人共175例(32.9%)，M0期病人共361例(93.5%)，N0期病人共348例(67.1%)。有吸烟史的肺腺癌病人共446例(85.6%)。随访结束时共有343例存活(64.1%)，192例死亡(35.9%)，平均生存时间为22.30(13.93±37.53)月。

表1 TCGA数据库中肺腺癌病人基本信息n=535，n(%)

临床变量结果生存状态存活343 (64.1)死亡192 (35.9)

2.2 ABCC2在肿瘤中的表达情况

采用TCGA数据库分析ABCC2在泛癌中的表达结果见图1A。ABCC2的表达水平在多个不同种类肿瘤的癌组织和癌旁组织中具有显著性差异，如膀胱癌、乳腺癌、肺鳞癌、肺腺癌等。其中，ABCC2在肺腺癌病人癌组织和癌旁组织中的表达水平情况见图1。图1B和图1C显示，ABCC2在癌组织中的表达水平高于癌旁组织(均P<0.05)。在535例癌组织和非配对59例癌旁组织中，ABCC2的表达水平存在差异(1.44±1.91 vs 0.46±0.21，P<0.001)；
同时，关于ABCC2在57例肺腺癌病人癌组织和配对癌旁组织中的表达水平结果显示出相同结果(1.35±1.89 vs 0.46±0.21，P=0.002)。

图1D和图1E展示了HPA数据库中通过免疫组化技术对ABCC2在正常肺组织和肺腺癌组织中的蛋白表达检测水平。结果显示，ABCC2在肿瘤组织中的蛋白水平高于正常肺组织。

图1 ABCC2在相关数据库中的表达情况

2.3 ABCC2高低表达组的差异表达基因

通过ABCC2 mRNA表达水平的中位数(0.65)将肺腺癌人群分为高表达组和低表达组，对其他基因进行差异性分析。见图2A(火山图)，以校正后P<0.05且|log2fold change|>1.5作为显著性差异表达标准，在高表达组和低表达组中共有3 542个基因差异表达，其中3 522个基因上调，下调基因共20个。其中fold change值最大的前10个基因分别为RNU5B-1、RNU5A-1、SNORA49、RNY1、RN7SKP255、G6PC、SNORA54、RNU2- 23P、AKR1C4、SNORA74A，其与ABCC2共表达热图见图2B。ABCC2相关差异表达基因的功能富集性分析结果显示，ABCC2及共表达基因参与细胞代谢、化学致癌过程、药物代谢等生物过程，提示ABCC2可能对相关物质代谢产生一定的影响(图2C和图2D)。

2.4 ABCC2基因表达与肺腺癌病人预后情况之间的关联性

采用差异性分析方法研究ABCC2基因表达与临床病理特征之间的关系，结果见图3。ABCC2的基因表达水平在不同病理分期及T、M、N分级情况下有差异(P均<0.001)。

图3 ABCC2基因表达与肺腺癌临床病理特征之间的关系

采用COX回归评估ABCC2 mRNA表达水平与肺腺癌病人预后情况之间的关联性。图4 Kaplan-Meier生存分析曲线展示了TCGA数据库中肺腺癌病人肿瘤组织中ABCC2基因表达水平的中位数(0.65)为分界点，将人群分为高低表达组并分析ABCC2不同表达水平与肺腺癌病人预后的关联性。COX回归结果显示HR(95%CI)值为1.46 (95%CI: 1.09～1.95,P=0.010)，提示ABCC2高表达与肺腺癌病人的死亡风险显著相关。ABCC2在不同特征肺腺癌人群中的Kaplan-Meier生存分析曲线结果见图5，也表现出相似的结果。

图4 Kaplan-Meier分析ABCC2过表达与肺腺癌预后的关联性

图5 ABCC2与肺腺癌病人预后的亚组分析

进一步在相关临床变量中筛选与肺腺癌病人总生存期相关的变量，结果见表2。单因素分析结果显示(图6)，与肺腺癌病人生存相关的临床变量为病理分期(P<0.001)、T分期(P=0.002)、M分期(P=0.006)、N分期(P<0.001)及ABCC2(P=0.010)。进一步将P<0.05的相关变量进行多因素分析，其中病理分期(HR: 1.73,95%CI: 1.12～2.67;P=0.013)、T分期(HR: 1.69,95%CI: 1.08～2.64;P=0.021)、N分期(HR: 2.04,95%CI: 1.39～2.99;P<0.001)及ABCC2(HR: 1.53,95%CI: 1.10～2.13;P=0.011)为与肺腺癌病人预后有显著性关联的独立危险因素。

表2 单因素和多因素分析ABCC2表达与肺腺癌预后之间的关联性

图6 ABCC2基因表达与肺腺癌预后分析森林图

2.5 GSEA鉴定ABCC2相关信号通路

通过对ABCC2高低表达组数据集采取GSEA分析，以识别肺腺癌中与ABCC2调控相关的信号通路。GSEA分析采用MSigDB数据集(c2.cp.kegg.v 7.0.symbols.gmt)进行，每次分析进行 1 000次基因集排列。与ABCC2高表达表型相关的差异富集通路定义为标准化处理后P< 0.05的信号通路，相关分析结果见表3。结果显示，drug metabolism other enzymes、PID/HNF3B pathway、porphyrin and chlorophyll metabolism、metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、pentose and glucuronate interconversions、WP glucuronidation、starch and sucrose metabolism、ascorbate and aldarate metabolism、reactome glucuronidation信号通路在ABCC2高表达表型中差异富集(图7)。

表3 GSEA分析肺腺癌中与ABCC2调控相关的信号通路

图7 GSEA分析与ABCC2显著关联的信号通路

本研究通过TCGA数据库探讨ABCC2基因过表达于肺腺癌预后的关联性。差异性分析显示ABCC2在肺腺癌肿瘤组织中存在过表达现象，且在不同临床病理特征分组情况下具有显著性差异。生存分析结果表明ABCC2过表达使肺腺癌病人的死亡风险显著升高。单因素及多因素回归结果证实ABCC2过表达是肺腺癌病人不良预后的独立危险因素。此外，本研究采用GSEA方法探讨肺腺癌中与ABCC2显著关联的信号通路，为探讨ABCC2对肺腺癌的发生发展产生作用的生物学机制提供了一定的理论依据。

研究表明，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC转运体)相关分子的高表达是造成肿瘤耐药性的重要原因之一[12-13]。其中，ABCC2经证实是ABC转运体家族的重要分子之一，与肿瘤化疗药物耐药有关，并由此可调控肿瘤的复发和转移[14]。Buchler M等人于1996年在大鼠肝脏中首次发现ABCC2的异常表达情况[15]。经研究发现，ABCC2基因在多种人体肿瘤中呈现过表达的现象，如肝癌、卵巢癌、结直肠癌等[16-18]。此外，ABCC2在肿瘤中表现出的遗传多态性，是导致其调控肿瘤细胞重要蛋白编码及表达的重要原因之一[19]。Lotte KV等[20]研究发现ABCC2在结直肠癌病人的肿瘤组织中mRNA表达水平远高于正常组织，且ABCC2高表达组病人的术后化疗效果较差。本次研究发现ABCC2在肺腺癌肿瘤组织中过表达，且ABCC2过表达可导致肺腺癌病人的死亡风险显著升高。以上研究结果均提示ABCC2过表达可能影响肺腺癌的发展进程，可能是肺腺癌预后预测的潜在生物标志物。

为进一步探讨ABCC2过表达在肺腺癌发展过程中的作用，本研究通过GSEA对肺腺癌中与ABCC2调控相关的信号通路进行了分析。结果显示药物代谢、能量代谢等信号通路与ABCC2过表达显著相关。ABC转运体可激活ATP酶并提前水解ATP，将药物转运至胞外，从而影响细胞内药物吸收，使胞内药物未能达到有效工作浓度，进而影响药物疗效[21- 24]。Korita PV等[14]研究发现肝癌病人中ABCC2过表达可影响顺铂类药物对肝细胞性肝癌化疗的效果。Sun L等研究发现结直肠癌中相关基因可通过诱导ABCC2过表达，进一步促进细胞耐药性的产生[25]。Zhang D等[26]研究发现口腔鳞状细胞癌中相关lncRNA可通过调控ABCC2的mRNA表达水平，从而影响顺铂类药物的化疗效果。ABCC2过表达在其他肿瘤中也表现出类似的药物耐药作用[27- 30]。结合本次GSEA分析结果，提示ABCC2可能通过影响肺腺癌靶向药物的代谢过程，从而影响肺腺癌的发展进程，对肺腺癌病人的预后产生一定的影响。

本研究通过TCGA数据库分析ABCC2与肺腺癌预后之间的关联性，发现ABCC2基因过表达使肺腺癌病人的死亡风险显著升高，ABCC2过表达可能是肺腺癌预后状况评估的潜在生物标志物。ABCC2可能通过影响肺腺癌靶向药物的代谢，从而对肺腺癌的发展进行调控。

猜你喜欢 关联性腺癌通路 益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的影响中成药(2018年7期)2018-08-04四物汤有效成分的关联性分析中成药(2017年3期)2017-05-17如何准确认定排污行为和环境损害之间的关联性中国环境监察(2016年12期)2016-10-24HIF-1a和VEGF-A在宫颈腺癌中的表达及临床意义西南军医(2016年3期)2016-01-23CRP检测与新生儿感染的关联性中国卫生标准管理(2015年6期)2016-01-14Kisspeptin/GPR54信号通路促使性早熟形成的作用观察中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-21抗磨白口铸铁化学成分自关联性分析中国铸造装备与技术(2015年5期)2015-12-10proBDNF-p75NTR通路抑制C6细胞增殖医学研究杂志(2015年3期)2015-06-10GSNO对人肺腺癌A549细胞的作用中国当代医药(2015年17期)2015-03-01HGF/c—Met信号转导通路在结直肠癌肝转移中的作用中国医药导报(2015年24期)2015-02-28