陆惠娴，于海滨，谢 涛，阮梦茹，Ambreen Iqal，姜 平，赵志辉

(广东海洋大学 滨海农业学院,广东 湛江 524088)

牦牛(Bosgrunniens，yak)主要分布于我国海拔3 000～5 000 m的青藏高原及其毗邻高山、亚高山地区，是高原地区特有的、耐粗饲、抗寒性能强和适应低氧环境的物种资源之一，受到当地牧民的长期驯养，是一种乳肉役兼用型品种。高原地区的低氧环境使得牦牛机体中糖酵解反应、酶活性及载氧能力增强等生理生化反应发生适应性的变化[1-4]，并影响着牦牛屠宰后的肉质特性的改变。肉品质主要包括营养品质、食用品质和加工品质三方面，评价营养品质的指标包括各种营养物质的含量，如脂肪酸含量、蛋白含量、氨基酸含量等；
评价食用品质和加工品质的指标包括肉色、pH值、系水力、风味物质含量和嫩度等[5]。

解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)是解偶联蛋白家族中的一员，是棕色和米色脂肪细胞特异性表达一种产热线粒体蛋白，其可以通过驱散电子传递链产生的电化学梯度，将底物氧化与ATP合成分离，从而导致热量释放，是在寒冷条件下维持体温或在哺乳动物(包括人类)摄入过多热量时维持能量稳态的机制中的关键因素[6-8]。目前大多数关于UCP1基因功能的研究主要集中在人和小鼠脂肪代谢、能量代谢和糖尿病方面[9-11]，而且本课题组前期组学分析发现：UCP1基因可能对脂质代谢具有重要调控作用，对肉牛肉品质性状可能具有重要的影响。有研究表明UCP1在牦牛心脏、肝脏、脾脏等各个组织中均有表达，但在肾脏组织中的表达量显著高于其他组织，并且UCP1基因在麦洼牦牛背最长肌以及肝脏中的表达量显著高于金川牦牛[12]。罗刚等[13]研究表明牛UCP1基因编码区存在5个错义突变多态性位点与牛抗寒性状存在显著相关性。安清明等[14]研究表明UCP1基因对绵羊的生长发育性状影响具有性别特异性，且携带等位基因A1的公羔群体具有较低的胴体性状。

因此，本试验初步探讨UCP1基因的遗传多态性与四川牦牛肉品质性状的相关关系，采用直接测序的方法验证UCP1基因的相关分子标记，为挖掘相关遗传标记为改善牦牛肉品质的标记辅助选择提供理论依据，为进一步阐明UCP1基因的功能奠定基础。

1.1 实验动物牦牛来自四川省阿坝州某牛场，采集了103头健康牦牛血液样品于-20℃保存，用于提取血液基因组DNA。

1.2 主要试剂全基因组血液DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
琼脂糖购自博格林生物有限公司；
Taq PCR Mix、1×TAE电泳缓冲液均购自诺维赞公司。

1.3 血液基因组DNA提取采用血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，步骤参照试剂盒说明书，使用NanoDropTMLite Spectrophotometer仪器检测DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.4 引物设计根据NCBI数据库提供的UCP1基因组序列(编号：ENSBMUG00000011219.1)，使用Primer 5.0软件进行UCP1基因的引物设计，上游引物：5′- TGGTAAAGAATCTGCCTGCG-3′；
下游引物：5′-TCTCCATCCCAAGCTGAATC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

1.5 目的基因PCR扩增及验证PCR反应体系(20 μL)：2×Green Taq Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。反应程序：95℃ 3 min；
95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；
72℃延伸5 min，4℃保存。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2.1UCP1基因PCR扩增产物验证PCR扩增获得的四川牦牛UCP1基因产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，PCR产物扩增特异性良好，无杂带，条带清晰(图1)，可直接用于测序鉴定。

M.DL2000 DNA Marker；
1～4.分别为不同个体的PCR扩增产物

2.2 测序结果UCP1基因的内含子4和外显子5中发现了4处SNPs位点，分别为I4-769 G>A、I4-836 C>T、E5-26 C>G和E5-59 A>G。4个SNPs的每种基因型测序结果如图2～5所示。

Ⅰ.基因型为GG的个体；
Ⅱ.基因型为GA的个体;Ⅲ.基因型为AA的个体

Ⅰ.基因型为CC的个体；
Ⅱ.基因型为CT的个体；
Ⅲ.基因型为TT的个体

Ⅰ.基因型为CC的个体；
Ⅱ.基因型为CG的个体；
Ⅲ.基因型为GG的个体

Ⅰ.基因型为GA的个体；
Ⅱ.基因型为AA的个体

表1 UCP1基因4个SNPs的群体遗传特性

2.4UCP1基因4个SNPs位点的不同基因型与四川牦牛肉品质的相关性分析使用SPSS 22.0单因素方差分析UCP1基因SNPs与牦牛肉品质的相关性，结果如表2所示，I4-769 G>A位点的AA型的背最长肌红度(a*)显著高于GG型；
在I4-836 C>T位点中CC型的背最长肌红度(a*)和黄度(b*)相对CT型显著升高(P<0.05)；
E5-26 C>G位点的CC型的背最长肌亮度(L*)显著低于CG型(P<0.05)，而CC型背最长肌红度(a*)和黄度(b*)显著高于CG型(P<0.05)；
E5-59 A>G位点的GA型的背最长肌24 h时的pH值显著高于AA型(P<0.05)。

结果表明，除E5-59 A>G位点外，其余SNPs位点均与牦牛背最长肌的肉色显著相关，推测其余3个SNPs位点能作为牦牛背最长肌肉色的分子标记位点；
E5-59 A>G位点与牦牛背最长肌2 h时的pH值显著相关，说明这个SNP可能是牦牛宰后pH值的分子标记位点，对肉质性状具有重要指导作用。

表2 UCP1基因4个SNPs不同基因型与牦牛肉品质的相关性分析结果

2.5UCP1基因不同单倍型组合与四川牦牛肉品质的关联分析使用Haploview 4.2软件对4个SNPs位点进行连锁分析，结果显示，I4-769 G>A、I4-836 C>T和E5-26 C>G这3个位点存在强连锁遗传，3个位点构成了一个结构域，共有6种不同的单倍型组合(图6，表3)。

LSD法分析6种单倍型组合与四川牦牛肉品质的关联性，结果如表3所示，H1H1和H1H2单倍型组合的背最长肌亮度(L*)显著低于H1H3单倍型组合(P<0.05)；
H2H2单倍型组合的背最长肌红度(a*)和黄度(b*)显著高于H1H3单倍型组合(P<0.05)；
而H2H2单倍型组合的背最长肌黄度(b*)显著高于H1H3和H2H3单倍型组合(P<0.05)。

图6 UCP1基因的牦牛群体SNPs位点连锁反应

表3 UCP1基因单倍型与牦牛肉品质的相关性分析结果

3.1 四川牦牛UCP1基因的遗传多态性综合评价群体遗传多样性的重要参数有遗传杂合度、等位基因数和多态信息含量等信息，是育种工作中的重要参考数据和指标[15]。3个参数均能衡量群体发生遗传变异的程度，较理想的杂合度为0.50～0.70；
PIC分为高度多态基因座(PIC>0.50)、中度多态基因座(0.25A、I4-836 C>T和E5-26 C>G位点的基因杂合度和多态信息含量均处在0.25～0.50范围内，表明这3个SNPs在群体多态性中属于中度多态性；
而E5-59 A>G位点的基因杂合度和多态信息含量均小于0.25，表明该位点在群体多态性中属于低度多态性，说明该群体具有一定的遗传选择潜力[14]。E5-26 C>G和E5-59 A>G位点的突变发生在外显子上，E5-26 C>G位点由编码丝氨酸的TCC突变成TCG和E5-59 A>G位点由编码亮氨酸的CTA突变成CTG，虽然2个位点的突变属于同义突变，密码子的简并性不会影响蛋白质分子的结构和功能，但同义密码子的使用模式存在一种密码子偏好性，即在蛋白质合成过程中基因编码同种氨基酸的几种同义密码子会被倾向其中的一种或几种的现象，这种偏好性被应用在提高特定蛋白质表达量、基因分类和基因功能预测以及研究蛋白质结构和功能方面[19]。宋乔乔[20]研究表明牦牛的密码子以G或C结尾的密码子偏好性更高，则提示E5-26 C>G和E5-59 A>G位点更偏好突变后的密码子。4个SNPs在牦牛群体中均处于哈代温伯格平衡，这可能是群体中个体间随机交配，没有新基因加入，没有发生迁移和遗传漂移，人工选择强度小。

3.2UCP1基因4个SNPs位点不同基因型与四川牦牛肉品质的相关性肉色是消费者视觉上的第一感官，能直接影响消费者的消费行为。而且肉色与肌肉中肌红蛋白含量、肌红蛋白氧化程度及高铁肌红蛋白含量有关，刚屠宰后肌肉中还含有大量还原型肌红蛋白，随着时间的增长，肌红蛋白会被空气中的氧气氧化，肉色会由鲜红色逐渐变成褐色[21]。评定肉色主要包括红度(a*)、黄度(b*)和亮度(L*)。L*的数值范围为0 (全黑) 到100 (全白)，数值越大代表肉色越亮，肌内脂肪含量越高；
a*的数值范围为从+127(洋红色)到-128(绿色)，数值越大则代表肉色越红；
b*数值范围为+127(黄色)到-128(蓝色)，肉类加工过程中黄度的变化会影响消费者的感官[22-24]。一般来说，在一定范围内，a*值越大，L*和b*越小，代表肌肉的颜色就越鲜红，说明肌肉品质就越好；
a*值太大而L*值太小就会形成黑干肉；
反之，L*值太大而a*值太小就会形成白肌肉[25-26]。本试验发现的I4-769 G>A位点的AA型、I4-836 C>T位点的CC型和E5-26 C>G位点的CC型的a*均最高，b*也高，L*却最低，这提示I4-769 G>A位点的AA型、I4-836 C>T位点中CC型和E5-26 C>G位点的CC型可作为改善牦牛肉色的最优基因型，为牦牛改善肉品质提供理论基础。而E5-59 A>G位点的GA型的背最长肌宰后24 h时的pH值显著高于AA型，且GA型肉色指标(a*、b*和L*)均高于AA型，由于屠宰后pH值的变化与肌肉中发生的糖酵解反应有关，随着时间的增长，糖酵解产生的乳酸越多，肉的pH值会从屠宰后的pH 6～7下降至极限值pH 5.4～5.6[27-28]，而且肌肉中的乳酸盐还会加快肌红蛋白的还原，提高肉色的稳定性[29]，因此，提示E5-59 A>G位点的GA型可作为提高牦牛宰后pH值的最优基因型，为选育优质肉品质品种的牦牛提供分子遗传标记。

3.3UCP1基因不同单倍型组合与牦牛肉品质性状的相关性基于单核苷酸多态性(SNP)分析只能发现保守和非保守分子功能有关的基因，而不能识别相互作用的等位基因连锁遗传，人们提出了另一种选择目标的方法——基于考虑到群体结构和个体间差异性关联的连锁不平衡(LD)[30-32]。因此，本试验发现I4-769 G>A、I4-836 C>T和E5-26 C>G这3个位点存在强连锁遗传，其中H1H1和H1H2单倍型组合的背最长肌亮度(L*)显著低于H1H3单倍型组合，H2H2单倍型组合的背最长肌红度(a*)和黄度(b*)显著高于H1H3单倍型组合，而且H2H2单倍型组合的背最长肌黄度(b*)显著高于H1H3和H2H3单倍型组合。结合UCP1基因的单个SNPs位点的分析结果可推测H2H2单倍型组合可作为改善牦牛肉色的最优单倍型组合，为提高牦牛选种选育效率提供一定的参考。

综上所述，本研究发现牦牛UCP1基因的内含子4和外显子5共存在I4-769 G>A、I4-836 C>T、E5-26 C>G和E5-59 A>G共4个SNPs位点。I4-769 G>A位点的AA型、I4-836 C>T位点的CC型和E5-26 C>G位点的CC型可作为改善牦牛肉色的最优基因型；
E5-59 A>G位点的GA型可作为提高牦牛宰后pH值的最优基因型；
H2H2单倍型组合可作为改善牦牛肉色的最优单倍型组合。本研究为牦牛改善肉品质标记辅助育种及建立优势优质群体提供了理论依据。

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