于琳琳，王 婧，丁惠玲，郑景珂，景晓平*

（1.上海市儿童医院／上海交通大学医学院附属儿童医院，上海 200062；

2.杭州医学院药学院，浙江杭州 310053）

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病［1-2］，全球儿童发病率不断上升，尤其是在发展中国家［3-4］，严重威胁患儿身心健康［5-7］，中医药治疗本病临床经验丰富，疗效显著。五虎汤加味是在五虎汤基础上结合甘草干姜汤加减成方，全方组成为麻黄、杏仁、石膏、桑白皮、细辛、黄芩、皂角刺、干姜、豆蔻、甘草，具有清肺化痰、止喘温中功效，其中前者在哮喘、肺炎喘嗽治疗过程中临床疗效显著［8-10］，后者治疗肺脾阳虚较多，故全方临床应用前景广阔。

课题组前期研究表明，五虎汤加味能显著改善哮喘患儿肺功能指标，降低IgE、EOS 计数和部分炎症因子水平，临床疗效显著［11］；
文献［12-13］报道，该方可减轻哮喘小鼠肺组织中气道炎症。因此，本实验建立HPLC 法同时测定五虎汤加味中黄芩主要成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素，干姜主要成分6-姜辣素，细辛主要成分细辛脂素，甘草主要成分甘草酸的含量，以期为该方质量控制提供依据。

1.1 仪器 Waters2695 型高效液相色谱仪，配置2996PDA 检测器、Empoer3 色谱工作站、自动进样器、四元梯度泵（美国Waters 公司）；
Milli-Q 超纯水器（杭州景元科技有限公司）；
PTF-A500 型电子分析天平（福州华志科学仪器有限公司）；
MewClassic MS 精密天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；
DKS-26 电热恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂）；
EYELA 冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司），SK-7210LHC 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 五虎汤加味组方药材分别购于上海市儿童医院、孙泰和国医国药馆、杭州开心大药房，经杭州医学院李元圆副教授鉴定为正品，凭证标本保存于杭州医学院药学院天然药物化学实验室。黄芩苷（批号FY09B712）、黄芩素（批号FY12970510）、6-姜辣素（批号FY19B0601）、细辛脂素（批号FY19B0809）对照品均购于南通飞宇生物科技有限公司，纯度≥98%；
甘草酸（批号190720）、汉黄芩苷（批号191207）对照品均购于上海融禾医药科技有限公司，纯度≥98%。甲醇为色谱纯（批号28.02.11），购自默克化工技术（上海）有限公司；
其他试剂均为分析纯；
水为超纯水（由Milli-Q 型超纯水器制得）。

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇制成黄芩苷、汉黄芩苷质量浓度分别为825.20、144.40 μg／mL 的贮备液Ⅰ，以及黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸质量浓度分别为31.00、63.40、24.40、99.60 μg／mL 的贮备液Ⅱ，将上述2 种贮备液等量混合，即得（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸质量浓度分别 为 412.60、72.20、15.50、31.70、12.20、49.80 μg／mL），置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.1.2 供试品溶液 取炙麻黄4.5 g、石膏20 g、杏仁9 g、桑白皮9 g、黄芩9 g、细辛3 g、皂角刺4.5 g、干姜3 g、豆蔻2 g、甘草6 g，粉碎后过3号筛，精密称取0.25 g，置于100 mL 圆底烧瓶中，加入20 mL 甲醇，在80 ℃下回流提取2 次，每次0.5 h，合并2 次提取液，放冷，转移至50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 分别取缺细辛、缺黄芩、缺干姜、缺甘草的阴性样品，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相水（含0.1%甲酸）（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～15 min，45%～48% B；
15～27 min，48%～60% B；
27～43 min，60%～68%B；
43～48 min，68%～71%B；
48～55 min，71% B）；
体积流量1.0 mL／min；
柱温30 ℃；
检测波长0～33 min 275 nm，33～40 min 280 nm，40～49 min 285 nm，49～55 min 250 nm；
进样量10 μL。理论塔板数按各成分色谱峰计算，不低于4 000，并且各成分分离度应不小于3.0。

2.3 专属性考察 精密吸取空白溶剂及对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，空白溶剂、溶液中杂质不干扰测定；
阴性样品溶液在对照品相应保留时间处无吸收，表明其他药味对测定无影响，该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，制成系列质量浓度，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度 精密吸取同一份对照品溶液10 μL，同一天内在“2.2” 项色谱条件下进样测定5 次，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积RSD 分别为0.16%、0.27%、0.42%、1.72%、1.46%、0.69%，表 明该方法日内精密度良好。

2.5.2 日间精密度 精密吸取同一份对照品溶液10 μL，每天在“2.2” 项色谱条件下进样测定5次，连续3 d，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积RSD 分别为0.48%、0.55%、1.01%、1.62%、2.84%、1.04%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积 RSD 分别为2.29%、1.51%、1.53%、2.06%、1.90%、2.55%，表明溶液在72 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取同一批本品粉末6 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸含量RSD分别为1.65%、1.82%、1.75%、1.85%，1.92%、2.78%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品粉末0.125 g，共9 份，每3 份1 组，分别加入高、中、低质量浓度（分别为已知含量的80%、100%、120%）的对照品溶液，每个质量浓度3 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸平均加样回收率分别为93.14%、98.48%、99.09%、100.36%，98.86%、93.98%，RSD 分别为2.54%、2.43%、2.59%、2.78%，2.60%、2.78%。

2.9 样品含量测定 取3 批样品粉末，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，每批平行2份，在“2.2” 项色谱条件下各进样测定2 次，外标法计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝3）

课题组前期采用HPLC-QTOF／MS 法对五虎汤加味进行分析，鉴定出苦杏仁苷、麻黄碱、伪麻黄碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、桑根酮C、桑根酮D、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素、细辛脂素等化合物，根据其极性、酸碱性、含量等差异，建立包含2 种条件的HPLC 法分别测定上述成分含量［14-16］。本实验报道了黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、6-姜辣素、细辛脂素的含量测定方法，后续将以乙腈-0.1%磷酸（含0.1%三乙胺）为流动相，测定苦杏仁苷、麻黄碱、伪麻黄碱等成分含量。

本实验根据各成分紫外吸收图谱，选择在275 nm波长处检测黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素，280 nm 波长处检测6-姜辣素，285 nm 波长处检测细辛脂素，250 nm 波长处检测甘草酸，实现了6 种成分含量的同时测定。在流动相筛选过程中，本实验考察乙腈-水（含0.1%甲酸）、甲醇-水（含0.1%甲酸）等系统，发现以后者洗脱时色谱峰峰形最好，基线噪音最低。再考察不同体积流量、柱温对各成分色谱峰分离度的影响，发现两者微小变化对测定结果影响不大，表明该方法具有良好的耐用性。

本实验建立HPLC 法同时测定五虎汤加味中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸的含量，该方法精密稳定，适用性、可靠性良好，可用于该方质量控制。

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