付满玲，姚淮育，侯筱芳，九 红，袁叶飞

1.西南医科大学科技处公共实验技术中心（泸州646000）；
2.西南医科大学药学院（泸州646000）；
3.泸州市人民医院重症医学科（泸州 646000）

药物的代谢主要在肝脏中进行，但伴随药物滥用情况的增加，药物性肝损伤的出现与发展也逐步增加[1]。对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是镇痛解热药，应用广泛[2]。在我国由于超过安全剂量服用APAP所致药物性肝损伤的发生是常见的医疗卫生、健康安全问题[3]。

赶黄草（Penthorum chinense Pursh）是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥地上部分。归肝经，微辛、性平、味苦、无毒，用于治疗黄疸、水肿等症。在苗族民间针对肝病的预防和治疗已有上千年的食用史和用药史[4]，安全无毒，疗效独特，认可度高，被誉为“神仙草”[5]。

肝损伤是各种各类肝病所共同表现出来的一种病理状态。多项研究表明，赶黄草对其有预防和保护作用［6-8］。通过分析，黄酮类化合物含量高、是其主要成分[9-11]，总黄酮是其主要功效成分[12]。项目组通过前期研究，萃取了赶黄草总黄酮（纯度＞50%，以乔松素计），主要由乔松素、异槲皮苷、山奈酚、槲皮素和芹菜素构成[12]，且有报道其为保护药物性肝损伤的成分[13-16]。

APAP常用于诱导药物性肝损伤，是便捷、有效、易复制的方法[17]。本研究用APAP 制备小鼠急性药物性肝损伤模型，探究赶黄草总黄酮对其保护作用及可能机制，为利用赶黄草总黄酮开发防治药物性肝损伤的药物和保健食品提供科学依据。

1.1 实验动物与饲养

昆明小鼠（体重20±2g），SPF 级，雄性，购自西南医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK（川）2018-17]，饲养温度18℃～22 ℃，湿度50%～60%，本研究经西南医科大学实验动物伦理委员会审核批准（批号：20200727）。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要实验试剂 赶黄草，来源于四川省泸州市古蔺县，经西南医科大学中药资源与鉴定研究教研室税丕先教授鉴定为虎耳草科扯根菜属植物赶黄草（Penthorum chinese Pursh）干燥全草；
本实验中使用的赶黄草总黄酮，是项目组在前期研究中自制而得，纯度为50.34%（以乔松素计），主要由乔松素、异槲皮苷、山奈酚、槲皮素和芹菜素组成，HPLC 指纹图谱见项目组前期研究[18]，制备方法为将赶黄草用含水乙醇加热回流得到提取物，然后将其放入聚酰胺柱色谱柱制得纯化物，批号为20 200621；
对乙酰氨基酚片（0.5 g），购自石药集团欧意药业有限公司，批号为016 191002；
联苯双酯，购自万邦德制药有限公司，批号为19j 200607；
谷氨酸-丙酮酸转氨酶/谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶/谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒，购自迈克生物股份有限公司，批号分别为1219051、0120051、0120091、0 720091；
肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒，购自杭州联科生物技术股份有限公司，批号分别为EK282/3-96、EK206/3-96；
丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒，购自南京建成生物，批号分别为A003-1、A001-3；
4%多聚甲醛，购自中国Biosharp-白鲨公司，批号为70081800。

1.2.2 主要实验仪器 7180型全自动生化分析仪，日立（HITACHI）公司；
mini spin 离心机，中国Eppendorf 公司；
TD-5Z 离心机，蜀科公司；
TECAN 酶标仪，奥地利Sunrise公司；
移液器，中国Enppendof公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、给药及处理 本课题组前期实验已检测出小鼠对赶黄草总黄酮的最大耐受量为33.6 g/kg[19]。虽已确定赶黄草为无毒性的药食两用植物，但因其成分复杂，根据本实验实际情况采用了人与动物等效剂量法，设立高、低两个剂量组，其剂量通常设为2:1，则本研究采用人与动物等效剂量法确定了赶黄草总黄酮高、低剂量两个分组，剂量设置分别为800 mg/kg和400 mg/kg。

适应性喂养50只雄性KM小鼠1周后，将其随机分为5组，每10只一组，分别为A组（正常组）、B组（模型组）、C组（阳性对照联苯双酯组，150 mg/kg）、D组（赶黄草总黄酮高剂量组，800 mg/kg）和E 组（赶黄草总黄酮低剂量组，400 mg/kg），各组按以上给药方案均每日灌胃（ig）给药，其中A 组及B 组均ig 等体积的蒸馏水（0.2 mL/10g），1 次/d，连续14 d，实验期间自由活动和饮食饮水。在末次ig 对应药物1 h 后，除了A 组腹腔注射（ip）等体积蒸馏水外，其余各组均ip 对乙酰氨基酚溶液（APAP 300 mg/kg）造模，然后所有组别禁饮食不禁水，期间观察其活动情况，经过16 h后，小鼠眼球取血，将取得的血液标本于4 ℃环境中静置1 h后，离心分离血清（3 000 r/min，10 min），小鼠脱臼处死后，及时解剖小鼠采集其肝脏，称量取得的肝脏组织重量并计算肝脏系数（计算公式如下），然后将肝脏组织分出一部分于-80 ℃中冻存备用以进行ELISA指标检测，另外的一部分组织使用固定液（4%多聚甲醛）进行固定以制作组织切片进行病理观察。

1.3.2 生化指标检测 取5 组小鼠静置离心后血清上清液，按照试剂盒相关操作说明对ALT、AST、LDH 和ALP 进行检测，采用7180 全自动生化仪来测定血清的生化酶指标水平；
与此同时，取5 组的肝脏组织，冰浴制备10%肝组织匀浆（按照1:9的比例来进行制备），取制备好的上清液，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，测定TNF-α、IL-6、SOD和MDA含量。

1.3.3 小鼠肝组织病理切片的制作与观察 将置于固定液中的肝脏取出，使用石蜡包埋好，然后完整、均匀切片（厚度约4 μm），用HE染色法，将以上制备好的肝组织切片置于光学显微镜下，观察对比记录相关病理学改变，比较分析5 组小鼠肝组织病理结构的改变和相关损伤情况。

1.4 统计学分析

用SPSS 17.0软件进行统计学的处理，数据以均数±标准差（）表示，用单因素方差分析（ANOVA）进行差异性检验，P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 赶黄草总黄酮对肝脏系数的影响

动物的肝脏系数在正常情况下是比较稳定；
但是动物肝脏损伤后，其肝脏系数会出现变化。动物肝脏系数的升高表明了肝脏有水肿、充血或增生肥大等异常情况的发生。B 组（模型组）较A 组（正常组）肝脏系数升高了11.60%，差异具有统计学意义（P ＜0.01），表明了本研究中B组的小鼠肝脏存在充血、水肿等情况；
D 组和E 组的肝脏系数相较于B 组分别降低了7.65%和7.06%，差异具有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

表1 赶黄草总黄酮对肝脏系数的影响（，n=10）Table 1 Effect of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient（，n=10）

表1 赶黄草总黄酮对肝脏系数的影响（，n=10）Table 1 Effect of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient（，n=10）

注：A组为正常组，B组为模型组，C组为阳性对照联苯双酯组，D组为赶黄草总黄酮高剂量组，E组为赶黄草总黄酮低剂量组；
与空白组比较，aP ＜0.01；
与模型组比较，bP ＜0.05

2.2 赶黄草总黄酮对小鼠血清肝功能指标ALT、AST、ALP和LDH水平的影响

肝脏功能变化时，血清中的谷丙转氨酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性的升高表示肝细胞膜受到了损伤，两数值的高低可从一定程度反映肝脏受到损伤的程度，并且是早期反映出变化的敏感性指标，而AST 升高则表示了损伤达到了细胞器[20]。碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）两个指标的升高可从一定程度上体现或反映小鼠的肝细胞受损伤程度和情况，在临床中也是常用于肝脏疾病诊断的指标[21]。B组（模型组）的ALT、AST、ALP 和LDH 与A 组相比均显著升高（P ＜0.01），表明了APAP导致了肝细胞膜受损，肝脏功能受到了损伤；
而D 组和E 组的ALT、AST、ALP、LDH 相较B 组降低了，具有显著的差异（P ＜0.01），见表2。

表2 赶黄草总黄酮对小鼠血清肝功能指标的影响（，n=10）Table 2 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum liver function indexes in mice（，n=10）

表2 赶黄草总黄酮对小鼠血清肝功能指标的影响（，n=10）Table 2 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum liver function indexes in mice（，n=10）

注：与空白组比较，aP ＜0.01；
与模型组比较，bP ＜0.01

2.3 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织TNF-α、IL-6 水平影响

肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的释放和浸润会促使细胞凋亡，引发炎症反应的发生，表现出不同程度危害，对机体正常的生理过程造成影响，甚至导致肝损伤[22]。与A组比较，B组的TNF-α水平和IL-6水平显著升高（P ＜0.01）；
与B组比较，D组的TNF-α和IL-6水平显著降低（P ＜0.01，P ＜0.05），E组TNF-α水平相较于B组显著降低（P ＜0.05），差异均具有统计学意义，见表3。

表3 赶黄草总黄酮对TNF-α、IL-6水平影响（，n=10）Table 3 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on TNF-α and IL-6 levels（，n=10）

表3 赶黄草总黄酮对TNF-α、IL-6水平影响（，n=10）Table 3 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on TNF-α and IL-6 levels（，n=10）

注：与空白组比较，aP ＜0.01；
与模型组比较bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.4 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织SOD、MDA水平影响

与A 组比较，B 组的肝组织SOD 含量显著降低（P ＜0.01），MDA 水平显著升高（P ＜0.01），表明使用APAP 造模后，小鼠肝组织受到了损伤，导致抗氧化的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，以及过氧化终产物的丙二醛（MDA）活性增加，机体失去正常调节氧化平衡能力，清除自由基能力下降。与B 组比较，D 组和E组的SOD 活性升高，MDA 水平降低，差异均具有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.05），见表4。

表4 赶黄草总黄酮对SOD和MDA的影响（，n=10）Table 4 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA（，n=10）

表4 赶黄草总黄酮对SOD和MDA的影响（，n=10）Table 4 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA（，n=10）

注：与正常组比较，aP ＜0.01；
与模型组比较bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.5 赶黄草总黄酮对小鼠肝组织病理变化的影响

2.5.1 大体肉眼观察 A 组小鼠的肝脏肉眼观察其形态及体积是正常的，外观颜色呈现为红褐色，质地触之有弹性、光滑且柔软；
而APAP损伤小鼠后，B组小鼠的肝脏重量及体积明显增大，表面有颗粒感和肿胀感，并且有明显的淤血；
进行了干预的C 组、D 组和E 组的肝脏受损情况有所改善，经观察接近正常组形态。

2.5.2 肝脏组织HE染色光镜观察 肝脏病理组织学检查常用于判断肝脏损伤，也是公认的金指标[23]。各组小鼠的肝组织病理变化光镜观察结果见图1。A 组小鼠肝结构清晰可辨且呈放射状分布排列，具有完整性，排列规整，细胞的形态正常无异，体积大小正常，无坏死变性等出现；
B组小鼠肝组织异常，肝小叶之间边界不清晰，形态异常，结构模糊，其排列极紊乱不整齐，肝细胞正常结构消失，胞质疏松，可见极其严重的肝细胞坏死，大量融合性出血性坏死（黑色箭头），出现炎性浸润小灶（黄色箭头），残留的肝细胞轻度肿胀；
C组的肝小叶结构比较清晰正常，损伤改善；
D 组和E 组肝小叶结构比较清晰可辨，损伤有改善，其中E组肝细胞有点状坏死，肝小叶中有炎性坏死小灶（蓝色箭头）。

图1 肝脏组织HE染色光镜观察结果（HE染色，×200）Figure 1 HE staining results of liver tissue under light microscopy（HE staining，×200）

用APAP诱导和制备药物性肝损伤模型，其优点是易复制、操作简便、使用广泛、成本低廉。一般情况下APAP作为家庭常用药在治疗剂量内使用是安全的[16]，但超安全剂量的使用或其他不正确的服用可导致急性药物性肝损伤[24]。APAP 损伤肝脏的作用机制为APAP 在肝脏中进行代谢的时候氧化产生少量反应性代谢产物，而产生的代谢产物会与还原型谷胱甘肽（GSH）相结合而耗尽肝细胞的GSH，从而导致多余的代谢产物不能被分解，此过程会破坏线粒体膜通透性及其功能，激发细胞内的氧化应激反应，引起脂质过氧化和蛋白质氧化，增加TNF-α 的表达，激活炎性因子诱发炎症反应，最终导致肝细胞变性、坏死[25-26]。

血清中ALT、AST、ALP、LDH属于肝脏受到药物性损伤的生物标志指标酶[27]，也是使用广泛、操作简便、成本低廉的检测方式，这些指标水平的高低反映了肝脏受到药物损伤的程度[28]。本研究中，APAP 诱导的药物性肝损伤模型组小鼠血清生物标志指标酶显著升高，而D组、E组ALT、AST、ALP、LDH水平显著降低，表明赶黄草总黄酮对APAP 引起的肝损伤起到了保护作用。

肝脏受到损伤时，活化的肝巨噬细胞将释放TNFα、IL-6等促炎细胞因子，引发炎性反应[29-30]，本研究中B组（模型组）小鼠肝组织的TNF-α、IL-6水平升高，而干预组TNF-α、IL-6 水平显著降低，表明赶黄草总黄酮可能通过降低炎性因子的表达、抑制炎症反应，从而对APAP引起的损伤产生保护作用。

脂质过氧化会导致细胞的膜完整性缺失，以致胞膜破裂和胞内微粒体酶渗漏[31]。SOD作为人体最主要的内源性抗氧化酶之一，能够清除氧自由基，抵抗氧化应激损伤[32]；
MDA作为脂质过氧化过程的终产物，其水平升的越高则表明机体受损的情况越严重。本研究中，赶黄草总黄酮能有效升高SOD 的活性、降低MDA含量，表明赶黄草总黄酮可通过抑制氧化应激反应而产生保护作用。

本研究发现赶黄草总黄酮对APAP 所致肝损伤小鼠的肝脏系数增加、血清相关指标水平以及肝组织炎性相关因子水平的升高均能有效降低，且能改善受损小鼠的肝脏病理状态，有效提高SOD 活性，降低MDA含量。赶黄草总黄酮能起到保护APAP 所导致的急性药物性肝损伤的作用，究其作用机制可能与抑制炎性反应和抗氧化作用相关。

（利益冲突：无）

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