谈秋瑜，吴 旭，纪 方，吴少云，颜 亮

1皖南医学院活性生物大分子安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002；
2海军军医大学附属长海医院，上海 200433；
3芜湖医药卫生学校，安徽 芜湖241000

骨肉瘤是一种主要发生于青少年的骨组织恶性肿瘤，其结缔组织能直接诱导产生肿瘤骨或骨样组织，常发生于管状骨，且预后不良［1,2］。虽然现在骨肉瘤的临床治疗方法不断完善，但由于骨肉瘤的高度异质性，经常出现转移性病例，而转移性病例的生存率仅仅只有20%［3,4］。因此，对骨肉瘤发展的具体机制进行进一步研究尤为重要。

微RNA（miRNA）是一类长度为18～24核苷酸的单链非编码RNA分子，通过序列互补特定识别并结合到靶基因mRNA的3′末端非翻译区域(UTR），抑制靶基因mRNA翻译，从而起到调控基因表达的作用［5］。现有研究证实miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡和迁移等细胞进程方面发挥了重要作用，在多种癌症中也发现miRNAs起到抑癌或促癌的作用［6,7］。在已有的研究中［8］，miR-125b-5p在多种肿瘤的发生与发展中发挥着重要的作用。有研究表明［9］，miR-125b-5p可以下调TPD52基因表达，从而影响乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。另有研究表明，miR-125b-5p在膀胱癌中呈现异常表达［10］。以往研究表明［11］，miR-125b通过抑制STAT3基因表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖及迁移。但由于miR-125b 的前体经过加工剪切后会形成miR-125b-5p 及miR-125b-3p 二种产物，因此有必要探讨哪一种miRNA在骨肉瘤中发挥具体作用。

RAB3D是分泌组织中表达的一类小分子GTP结合蛋白，该蛋白参与膜运输，并在细胞增殖、凋亡及迁移方面发挥了重要作用［12］。研究表明，RAB3D在多种癌症的发展中发挥了作用，如：RAB3D促进了食管鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移［13］；
另有研究表明，RAB3D通过影响CDΚ4和CDΚ6信号传导来刺激肿瘤细胞周期进程，从而影响肿瘤细胞增殖［14］。而在骨肉瘤中有关miR-125b-5p调控RAB3D的研究还未见报道，亟需进一步研究。

本文通过生物信息学预测，miR-125b-5p可能结合的靶基因为RAB3D，并研究了RAB3D对骨肉瘤细胞增殖及迁移的影响，在体外探讨了miR-125b-5p通过调控RAB3D抑制骨肉瘤增殖及迁移的具体机制。

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人骨肉瘤细胞MG63、HOS、永生化人软骨细胞hFOB1.19（中科院上海细胞库）。

1.1.2 试剂 Lipofectamine 3000（Thermo）；
DMEM 培养基（Gibco）；
胰酶（Gibco）；
胎牛血清（Sigma）；
RIPA裂解液（碧云天）；
BCA 蛋白浓度检测试剂（Thermo Fisher）；
DMSO（Sigma）；
GAPDH I 抗、RAB3D I 抗（Proteintech）；
山羊抗兔II抗（Santa cruz）；
山羊抗鼠II抗（Santa cruz）；
G418（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞系MG63、HOS细胞及人软骨细胞hFOB1.19培养于37 ℃的恒温培养箱中，用含有10%的血清的DMEM 培养，待细胞融合度长至80～90%时，进行下一步实验。

1.2.2 细胞转染 将细胞在六孔板中培养，待细胞融合度达到60%～70%时，按照Lipofectamine 3000的说明书将等量的miR-125b-5p过表达（miR-125b-5p mimic，广州锐博生物科技有限公司）及抑制剂（miR-125b-5p inhibitor，广州锐博生物科技有限公司）、RAB3D过表达质粒（OE-RAB3D，上海吉玛制药有限公司）及siRNA（si-RAB3D，上海吉玛制药有限公司）转染到骨肉瘤细胞中。细胞分组为：Control mimic；
miR-125b-5p mimic；
Control inhibitor；
miR-125b-5p inhibitor；
Si-control；
Si-RAB3D；
OE-control；
OE-RAB3D；
Control mimic+OE-control；
Control mimic+OE-RAB3D；
miR-125b-5p mimic+OE-control；
miR-125b-5p mimic+OE-RAB3D。

1.2.3 生物信息学分析筛选miR-125b-5p可能结合的靶基因 为找出miR-125b-5p可能调控的靶基因，通过3种不同的生物信息学软件［15］（TargetScan、miRanda 及PicTar）筛选可能结合miR-125b-5p的靶基因。在候选靶基因中，3种软件一致预测RAB3D是miR-125b-5p结合的靶基因。

1.2.4 细胞迁移实验 在24孔板中每孔加入600 μL的含有20%血清的DMEM，将MG63细胞用不含血清的DMEM重悬，含有5×103MG63细胞的Transwell小室插入24孔板中。24 h后将Transwell小室取出，PBS清洗一遍后放入4%多聚甲醛中，室温固定20 min，用PBS清洗3遍，放入0.5%的结晶紫溶液中染色15 min，1×PBS清洗3遍后，使用电子显微镜（Olympus BX51）进行拍照。

1.2.5 细胞增殖实验 细胞增殖实验使用EdU试剂盒法，根据说明书按照以下步骤操作：加入稀释的EdU溶液（每1 mL完全培养基中加人EdU溶液1 μL）1 mL于37 ℃孵育2 h；
随后，PBS清洗3遍，加入150 μL的4%多聚甲醛固定30 min；
吸掉培液，再加入浓度为2 mg/mL的甘氨酸溶液150 μL，室温孵育5 min；
PBS 清洗3遍，随后加入250 μL的渗透液（0.5%Triton×100）孵育10 min；
PBS清洗1遍；
加入250 μL/孔的染色液（Appollo染色液）室温避光30 min，渗透液清洗3 次，10 min/次；
随后用1×DAPI进行细胞核染色30 min，再用PBS清洗2 次；
最后采用Olympus BX51 荧光显微镜察并拍照。

1.2.6 总RNA提取和qRT-PCR 细胞总RNA提取使用RNA 快速提取试剂盒进行，并使用逆转试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA。通过qRT-PCR 法测定miR-125b-5p表达量（U6 作为内参基因）及RAB3D mRNA表达量（GAPDH作为内参基因）。RAB3D和GAPDH引物序列如表1所示。数据计算使用2-△△法。

表1 RAB3D及GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences for RAB3D and GAPDH

1.2.7 蛋白提取和Western blot 使用RIPA裂解细胞，冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min；
取上清，使用BCA法对蛋白质进行定量，随后加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，100 ℃金属浴，5 min。10%SDSPAGE电泳后，开始转膜（300 mA，90 min），转膜结束后，将膜放入5%脱脂奶粉中，封闭1 h。最后加入RAB3D I抗（1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜。第2天，将膜取出加入1×TBST清洗6遍（5 min/遍）。随后，加入II抗（1∶5000稀释），常温孵育1 h，将膜取出，1×TBST清洗6遍（5 min/遍）。将膜置于曝光板，确保正面朝上，加入发光底物，化学发光成像仪曝光。

1.2.8 数据统计 数据统计与分析运用SPSS v17.0软件，数据以均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 miR-125b-5p抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移

qRT-PCR结果表明（图1A），与正常的人软骨细胞hFOB1.19相比，在MG63与HOS细胞中miR-125b-5p的表达量分别只有人软骨细胞hFOB1.19 的67.7%（P＜0.05）及3.27%（P＜0.05）。细胞增殖实验结果（图1B～E）显示，在过表达miR-125b-5p时，与对照组相比，MG63细胞和HOS细胞的增殖能力分别被抑制了36.1%（P＜0.05）及29.4%（P＜0.05）；
而在抑制miR-125b-5p时，与对照组相比，MG63细胞和HOS的增殖能力分别升高了1.32倍（P＜0.05）及1.26倍（P＜0.05）。细胞迁移实验的结果（图1F～I）显示，在过表达miR-125b-5p时，与对照组相比，MG63细胞和HOS细胞的迁移能力分别被抑制了50.3%（P＜0.05）及50.8%（P＜0.05）；
，而在抑制miR-125b-5p 时，与对照组相比，MG63 细胞和HOS细胞的迁移能力分别升高了2.15 倍（P＜0.05）及1.41倍（P＜0.05）。

图1 miR-125b-5p对骨肉瘤MG63细胞和HOS细胞增殖及迁移的影响Fig.1 Effect of miR-125b-5p expression level on proliferation and migration of osteosarcoma cells.A:qRT-PCR of miR-125b-5p expression in hFOB1.19,MG63 and HOS cells.B,C: EdU assay of MG63 cells transfected with miR-125b-5p mimic or inhibitor (Original magnification: ×100).D,E: EdU assay of HOS cells transfected with miR-125b-5p mimic or inhibitor(×100).F,G:Migration assay of MG63 cells transfected with miR-125b-5p mimic or inhibitor (×100).H,I: Migration assay of HOS cells transfected with miR-125b-5p mimic or inhibitor.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 生物信息学预测并验证miR-125b-5p调控RAB3D基因表达

通过3种生物信息学软件，预测了miR-125b-5p可能结合的靶基因。3种软件一致得出RAB3D是miR-125b-5p可能结合的靶基因（图2A），且RAB3D与miR-125b-5p的结合能为-20.6 kcal/mol，符合miRNAs与靶基因结合的结合能范围之内。qRT-PCR结果表明（图2B），转染miR-125b-5p mimic到骨肉瘤细胞后，与对照组相比，细胞内的m125b-5p明显升高（P＜0.05）；
而转染miR-125b-5p inhibitor到细胞后，细胞内的miR-125b-5p明显降低（P＜0.05）。Western blot 实验显示（图2D、E），转染miR-125b-5p mimic到骨肉瘤细胞后，RAB3D的蛋白表达水平与对照组相比显著降低（P＜0.05）；
转染miR-125b-5p inhibitor 到骨肉瘤细胞后，RAB3D 的蛋白表达水平与对照组相比显著升高（P＜0.05）；
而RAB3D的mRNA水平，与对照组相比，变化无统计学意义（图2C）。

图2 骨肉瘤中miR-125b-5p调控RAB3D基因表达Fig.2 miR-125b-5p regulates RAB3D gene expression.A:Duplex structures of miR-125b-5p and the 3′UTR of RAB3D.B:qRTPCR of miR-125b-5p expression in cells transfected with control mimic/inhibitor or miR-125b-5p mimic/inhibitor.C:qRT-PCR of RAB3D mRNA in cells transfected with control mimic/inhibitor or miR-125b-5p mimic/inhibitor.D,E:Western blotting of cells transfected with control mimic/inhibitor or miR-125b-5p mimic/inhibitor.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 RAB3D促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移

Western blot实验结果（图3A）显示在骨肉瘤细胞HOS、MG63细胞中，RAB3D的蛋白表达量较正常人软骨细胞分别升高了3.37倍（P＜0.05）及2.07倍（P＜0.05）。Western blot实验结果显示，在MG63细胞（图3B～E）与HOS细胞内过表达RAB3D后，其蛋白表达量与对照组相比明显升高（P＜0.05），在细胞内干扰RAB3D的表达后，其蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。细胞增殖实验结果（图3F～I）显示，RAB3D蛋白水平过表达后，骨肉瘤细胞MG63与HOS的增殖能力与对照组相比，分别升高了1.67倍（P＜0.05）及1.21倍（P＜0.05）；
而RAB3D蛋白表达水平被抑制后，骨肉瘤细胞MG63与HOS的增殖能力与对照组相比，分别抑制了36%（P＜0.05）及29.3%（P＜0.05）。细胞迁移实验的结果显示（图3J～M），RAB3D蛋白水平过表达后，骨肉瘤细胞MG63与HOS的迁移能力与对照组相比，分别升高了1.63倍（P＜0.05）及1.35倍（P＜0.05）；
而RAB3D蛋白表达水平被抑制后，骨肉瘤细胞MG63与HOS的迁移能力与对照组相比，分别抑制了65%及57.4%（P＜0.05）。

图3 RAB3D促进了骨肉瘤MG63细胞和HOS细胞的增殖及迁移Fig.3 Effect of RAB3D expression level on proliferation and migration of osteosarcoma cells.A: Western blotting for detecting RAB3D expression in hFOB1.19,HOS and MG63 cells.B,C:Western blotting of RAB3D expression in MG63 cells transfected with RAB3D siRNA or overexpression vector.D,E.Western blotting of RAB3D expression in HOS cells transfected with RAB3D siRNA or overexpression vector.F,G:EdU assay of MG63 cells transfected with RAB3D siRNA or overexpression vector(×100).H,I:EdU assay of HOS cells transfected with RAB3D siRNA or overexpression vector(×100).J,K:Migration assays of MG63 cells transfected with RAB3D siRNA or overexpression vector(×100).L,M:Migration assay of HOS cells transfected with RAB3D siRNAor overexpression vector(×100).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 miR-125b-5p调控RAB3D基因表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖和迁移

因此本研究在两种骨肉瘤细胞MG63和HOS中设置4个不同的组别：Control mimic+OE-Control，OERAB3D+Control mimic，miR-125b-5p+OE-Control，miR-125b-5p mimic+OE-RAB3D。细胞增殖实验结果（图4A～D）显示，提高RAB3D的表达明显促进了骨肉瘤细胞的增殖能力（P＜0.05），而这种被提高的增殖能力在同时过表达miR-125b-5p后被阻断。细胞迁移实验结果（图4E～H）显示，提高RAB3D的表达明显促进了骨肉瘤细胞的迁移能力（P＜0.05），而这种被提高的迁移能力在同时过表达miR-125b-5p后被阻断。

图4 miR-125b-5p调控RAB3D基因表达抑制骨肉瘤细胞的增殖及迁移Fig.4 Overexpression of miR-125b-5p inhibits proliferation and migration of osteosarcoma cells by downregulating RAB3D expression.A,B:EdU assay of MG63 transfected with control mimic+OE-control,control mimic+OE-RAB3D,miR-125b-5p mimic+OE-control,or miR-125b-5p mimic+OE-RAB3D (×100).C,D: EdU assay of HOS cells with different transfections(×100).E,F:Migration assay of MG63 cells with different transfections (×100).G,H: Migration assay of HOS cells with different transfections(×100).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

有研究表明，miR-125b-5p在多种癌症中发挥了调控作用［16］。如miR-125b-5p通过调控SOX12基因的表达抑制了乳腺癌细胞的转移［17］。miR-125b-5p通过调控TXNRD1基因的表达抑制了肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭［18］。上述研究表明，miR-125b-5p在多种肿瘤中抑制了肿瘤的发展。虽有研究表明，Circular RNA 0086996 通过吸附miR-125b-5p在骨肉瘤中调控了肿瘤的生长及迁移［19］，但miR-125b-5p在骨肉瘤中发挥功能的具体作用机制还不明确。本研究以此作为切入点，选择miR-125b-5p作为研究对象。我们比较了正常人软骨细胞与骨肉瘤细胞中的miR-125b-5p的含量，发现在骨肉瘤细胞系中低表达，随后我们通过干预miR-125b-5p的表达证实了miR-125b-5p抑制骨肉瘤细胞的增殖及迁移，这与已有的研究结果相一致［19］。

随后，本研究通过3 种生物信息学软件，预测了miR-125b-5p可能结合的靶基因为RAB3D。RAB3D作为RAS癌基因家族成员之一，在多种癌症进展中起到了重要的作用［20-22］。目前，已有报道在多种癌症中存在miRNAs调控RAB3D基因表达的机制，如miR-30b-5p通过靶向RAB3D抑制肾癌细胞增殖和迁移能力［23,24］。但关于骨肉瘤中miR-125b-5p调控RAB3D的研究还未见报道。本研究通过在二种骨肉瘤细胞中干预RAB3D基因的表达，通过体外功能实验，发现RAB3D促进了骨肉瘤细胞的增殖与迁移，这与miR-125b-5p对骨肉瘤细胞增殖及迁移的作用相反。

随后，本研究在骨肉瘤两个细胞系中通过western blot实验证实了骨肉瘤中miR-125b-5p可以在转录后水平调控RAB3D基因的表达，同时通过细胞回复实验也证实了miR-125b-5p通过调控RAB3D的表达进而抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移。研究表明，多个miRNA可以调控一个基因的表达进而抑制或者促进肿瘤进程［25］。结合文献及我们的研究成果，本研究发现miR-125b-5p通过调控RAB3D的表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖与迁移，为miR-125b-5p抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移提供了一个新的作用机制。

RAB3D是原癌基因RAS基因家族的成员，参与调控信号传导、细胞增殖等生物过程［26,27］。在先前的报告中，RAB3D在各种类型的癌症中表达失调［20,27］。骨肉瘤的不断增殖与远处转移是骨肉瘤患者预后不良、生存期短的主要原因。已有研究表明RAB3D可以通过调节PI3Κ/Akt 信号通路参与到肿瘤细胞的增殖和转移［28,29］。而PI3Κ/Akt信号通路在调节细胞功能方面起着关键作用，包括生存、分化、血管生成、侵袭和转移［30］，且越来越多的证据表明PI3Κ/Akt信号通路在骨肉瘤中起重要作用［31］。结合现有文献与我们的研究成果，推测miR-125b-5p可以通过调控RAB3D的表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖与迁移，是由于PI3Κ/Akt信号通路的改变。因此在今后的研究中我们将进一步深入探讨。

综上所述，本文新发现并证实miR-125b-5p可以通过靶向调控RAB3D基因的表达从而抑制骨肉瘤细胞的功能，该发现阐明了miR-125b-5p抑制骨肉瘤细胞功能的具体分子机制。该研究结果也补充了既往关于骨肉瘤miRNA调控RAB3D表达的研究，为未来miR-125b-5p作为骨肉瘤治疗的潜在核酸药物提供新的理论基础。

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