轩栋栋，贾宏昉，郭仕平，谢良文，伍德洋，秦艳青，杨兴有，冯长春

（1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450000；
2.四川省烟草公司，四川 成都 610000；
3.四川省烟草公司凉山州公司，四川 凉山 615000）

上部烟叶是烤烟单株生产力的重要组成部分。优质的烤烟上部叶在卷烟产品设计中占有非常重要的地位。但近年来，我国烤烟成熟度不够、上部叶可用性不高，无法在工业生产中大规模用于优质卷烟的生产，成了烟草工农业生产中的焦点矛盾之一。烤烟上部叶物质积累较多、组织结构紧密、烟碱含量偏高、还原糖及糖碱比低、内在化学成分不协调，在烘烤过程中常存在定色难、易挂灰、青筋烟比例高等问题[1]。因此，采取有效措施提高上部叶成熟度和品质，对提高烤烟上部叶可用性具有重要意义。

烤前预先对烟叶进行后熟处理可以使烟叶形成失水胁迫，增加叶片与主脉的水势差，促进主脉水分向叶片迁移散失，进而调整主脉失水，保证烟叶的失水协调[2]；
相关研究表明，后熟失水凋萎后烟叶的生理代谢加快，变黄时间缩短[3]。目前，后熟技术在实际应用中多用于香蕉、猕猴桃、软肉梨等，以提高水果的色泽和品质[4-5]。在烤烟中后熟技术的研究多关注于烘烤过程中烟叶的失水特性及形态变化[6-7]，而对其成熟度、内含物变化、褐变机制等未进行充分阐述。为此，设置4个不同的后熟处理，对烟叶褐变程度、细胞超微结构、糖类物质含量、脂肪酸含量、糖代谢和脂质代谢关键基因表达量进行分析，旨在研究后熟处理对烤烟上部叶成熟度和烘烤品质的影响，以期为提高烤烟上部叶质量和可用性提供参考。

1.1 试验材料

试验于2020—2021 年在四川省凉山州盐源县基地开展，品种为云烟87，选取上部叶为供试材料。

1.2 试验设计

在当地烟叶适熟季节，采收落黄均匀、长相一致的上部叶（第13～16 片叶），设置正常采烤烟叶（CK）、12 h 后熟处理烟叶（H1）、24 h 后熟处理烟叶（H2）、36 h 后熟处理烟叶（H3）共4 个处理。每个处理5杆，放入密闭空置烤房中进行后熟处理，放置至试验计划时间后移入烤房内，与当地正常采烤烟叶一起开始烘烤。同时各处理取10片烟叶，用于细胞超微结构观察、脂肪酸含量和脂氧合酶（LOX）活性测定。烘烤完成后，各处理取10 片烤后样，用于还原糖、总糖和淀粉含量的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 褐变程度测定 每个处理选取烘烤过程中的5 片烟叶用于褐变程度测定，采用Photoshop 像素法[8]计算烟叶变褐部分面积与总叶片面积（图1），从烟叶烘烤开始每隔24 h 进行褐变比例统计，测定变褐程度，计算变褐速度。

图1 Photoshop像素法示例Fig.1 Photoshop pixel method example

1.3.2 经济性状统计 依据GB 2635—92中的方法对烤烟进行分级，计产计值[9]。

1.3.3 细胞超微结构观察 选取各处理叶片第5到第7 支脉之间右侧相同的位置，用手术刀切成1 mm×1 mm 的小块，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS 缓冲液配制）中固定。透射电镜观察角质层：用1%锇酸（pH 值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS缓冲液配制）固定，经纯丙酮脱水后用Epon812 环氧树脂包埋聚合；
用Leica EM UC6 Miultracut 超薄切片机（德国Wetzlar 公司）切出超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，再用JEM-1400 Plus 型透射电镜（日本电子株式会社）进行观察并拍照；
每个处理观察10 个视野，同时测定淀粉粒数量和面积[10]。

1.3.4 还原糖、总糖和淀粉含量测定 取不同处理烤后样，采用德国seal AA 流动分析仪测定还原糖、总糖和淀粉含量[11]。

1.3.5 脂肪酸含量测定 烟叶脂肪酸含量采用YC/T 288—2009《烟草及烟草制品 多元酸（草酸、苹果酸和柠檬酸）的测定 气相色谱法》中的方法进行测定[12]。

1.3.6 LOX 活性的测定 LOX 活性采用北京索莱宝科技有限公司生产的酶活性试剂盒按照说明书方法进行测定。

1.3.7 糖代谢及脂质代谢相关基因表达量测定

在变黄期42 ℃烘烤72 h时选取各处理叶片，使用Eastep®Super Total RNA Extraction Kit（上海普洛麦格生物产品有限公司）提取烟叶总RNA，测定所提总RNA 的OD260/280值，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，使用HiScript®Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）进行反转录，反转录产物作为qRT-PCR 反应的模板。引物（表1）设计采用Primer Premier 5.0 软件。qRT-PCR 反应按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）说明书进行，3 次重复，内参基因为烟草组成型表达基因NtL25。基因表达量采用2-△△Ct法计算。

表1 烟草糖代谢及脂质代谢相关基因的qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences of genes related to glucose metabolism and lipid metabolism in tobacco

1.4 数据分析

利用SPSS 21 软件进行数据处理和分析，采用Origin 2019软件进行绘图。

2.1 不同后熟处理对烤烟上部叶褐变的影响

褐变比例分析结果表明（图2A），烘烤过程中后熟处理烟叶褐变时间发生晚，褐变速度慢，褐变比例降低，并随后熟时间的增加效果呈上升趋势。对烤后烟叶褐变情况结果分析，各后熟处理烟叶褐变现象均有所降低，其中H2 处理最为显著，轻度褐变烟叶比例较CK 处理下降34.39%，中度及以上褐变烟叶比例下降 43.02%（图 2B）。说明后熟处理对降低上部叶褐变程度有着重要作用。同时烤后烟叶各等级比例统计结果显示，各后熟处理烟叶上等烟比例分别提高3.63%、17.29%、7.70%，H2 处理整体中上等烟比例较CK 处理提高5.39%，在提高烤后烟叶品质方面效果显著。

图2 不同后熟处理烟叶烘烤中褐变比例（A）和烤后烟等级（B）Fig.2 Browning ratio（A）and cured tobacco grade of tobacco leaves（B）with different post-ripening treatments

2.2 不同后熟处理烤烟上部叶细胞超微结构观察

为研究不同后熟处理对烤烟上部叶细胞发育结构的影响，通过透射电镜对上部叶发育结构进行分析，如图3所示，正常处理烟叶细胞栅栏组织中叶绿体及其他细胞器均近细胞壁分布；
叶绿体所含淀粉粒数量多，体积小；
嗜锇颗粒含量少且体积相对较小。随着后熟时间的增加，烟叶中叶绿体及其他细胞器逐渐在细胞腔中游离分布，淀粉粒体积增大，数量减少，嗜锇颗粒含量增多且体积增大。不同处理烤后烟叶的淀粉、总糖、还原糖含量的测定结果显示（表2），与CK 处理相比，后熟处理的烟叶淀粉含量降低，总糖和还原糖含量升高。其中，H2处理还原糖和总糖含量分别提高53.33% 和16.33%，H3处理淀粉含量降低5.61%。

图3 不同后熟处理烤烟细胞超微结构观察（×5 000）Fig.3 Observation on cell ultrastructure of flue-cured tobacco with different post-ripening treatments（×5 000）

表2 不同后熟处理烟叶的淀粉粒数量、面积及烤后样化学成分含量Tab.2 The quantity，area of starch granules and chemical composition in flue-cured tobacco leaves after different post-ripening treatments

续表2 不同后熟处理烟叶的淀粉粒数量、面积及烤后样化学成分含量Tab.2（Continued）The quantity，area of starch granules and chemical composition in flue-cured tobacco leaves after different post-ripening treatments

2.3 不同后熟处理烤烟上部叶LOX活性及脂肪酸含量分析

如图4所示，通过不同时间后熟处理的上部叶，除肉豆蔻酸外（图4A），各脂肪酸含量均呈现下降趋势，其中3 个后熟处理在棕榈酸含量和花生酸含量上降低最为明显，均达到极显著差异（图4B、D）。H3 处理的硬脂酸含量和亚油酸含量相较CK 处理分别降低35.61%、25.77%，达极显著差异（图4C、F）。脂肪酸含量整体随后熟时间的增加呈下降趋势（图4G），同时LOX活性增加（图4H），这表明后熟处理对提高上部叶成熟度作用明显。

图4 不同后熟处理烟叶脂肪酸含量和LOX活性分析Fig.4 Analysis of fatty acid content and LOX activity in different post-ripening treatments of tobacco leaves

2.4 不同后熟处理对烤烟上部叶脂质代谢及糖代谢关键基因表达的影响

从图5 可以看出，在烟叶变黄关键时期测定蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖转化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGP）表达量，结果显示，随后熟时间的增加，糖代谢途径关键基因SS、INV和AGP表达量均呈下降趋势，尤其是H2和H3处理的SS、INV基因表达量较CK 处理下降达极显著水平。这表明后熟处理可以对烟叶的淀粉合成起抑制作用。后熟处理烟叶的 3个脂质代谢关键基因表达量均呈下降趋势，较长时间的后熟处理对基因表达量的影响较大，其中各后熟处理脂质转运蛋白基因1（LTP1）较CK 处理均极显著降低，H3 处理的蜡质合成基因10（CER10）、MYB 家族基因48（MYB48）相对表达量分别极显著降低85.40%、74.39%。这说明经过后熟处理，烟叶在烘烤过程中的脂质代谢水平有很大程度的降低。

图5 不同后熟处理烟叶脂质代谢及糖代谢途径关键基因相对表达量Fig.5 Relative expression of key genes in lipid metabolism and glucose metabolism pathway in different post-ripening treatments of tobacco leaves

烤烟上部叶多存在着叶片偏厚、色深、组织结构紧密、成熟度较差、内在化学成分不协调等一系列的问题，这就导致了上部叶烘烤品质差，可用性不高。本研究以不同后熟处理的云烟87 上部叶为供试材料，研究证明后熟处理能有效提高上部叶成熟度，在烘烤过程中褐变速度减缓、褐变程度减轻，烤后烟中上等烟比例显著提高。

烤烟的品质与淀粉含量密切相关，烟草中淀粉的分解、转化、消耗和积累决定着烟叶品质和外观等级的优劣[13]。而糖代谢是淀粉积累分解的重要环节，受多种酶活性影响。其中蔗糖合成酶（SS）主要调节蔗糖的降解，为淀粉合成提供底物，其活性的高低与淀粉积累量相一致[14]；
而蔗糖转化酶（INV）被认为是控制淀粉合成的关键酶[15]；
另外，焦磷酸化酶（AGP）为淀粉生物合成的限速酶，决定淀粉合成的速率和最终合成量[16]。因此，这3 个基因表达量的高低意味着烟叶中内含物积累的状况。本研究发现，后熟处理烟叶中，这3个基因表达量均显著降低，表明烘烤过程中淀粉的合成受到抑制，这与细胞超微结构观察结果淀粉粒数量随后熟时间的增加而减少，以及烤后烟叶淀粉含量显著降低的结果相一致。

LOX 是一种广泛存在于植物组织中以不饱和脂肪酸为底物的酶，在植物生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中起重要调节作用[17]。研究表明，LOX活性多随植物的成熟衰老逐渐升高[18]。LOX活性测定分析表明，随着后熟处理时间的增加，LOX活性逐渐升高，该结果一定程度上说明了后熟处理能有效提高烟叶成熟度。

上部叶烘烤过程中易挂灰褐变，严重影响了品质和可用性。在其他作物上关于褐变的研究报道颇多，杨芳等[19]通过降低板栗的不饱和脂肪酸含量，减轻贮藏加工过程中的褐变反应；
李静等[20]通过延缓双孢菇脂质过氧化进程，降低其褐变指数；
洪宇等[21]研究发现，低温胁迫下随着玉米褐变程度加深，其脂肪酸含量增加。这都说明脂质氧化对褐变反应有重要影响。这与后熟处理后烟叶不饱和脂肪酸含量降低，烘烤过程中褐变速度减缓、褐变程度减轻的结果相一致。

烟叶在烘烤过程中脂肪酸的代谢氧化是一系列复杂的生理生化过程，是内在分子机制调控的结果，与多种基因的表达有关。本研究选取3 个与脂质代谢相关的基因，其相对表达量测定分析结果表明，与正常处理烟叶相比，24 h 和36 h 后熟处理烟叶相关基因表达量均下调，且差异显著。脂质转运蛋白（LTP）能够结合并转运多种脂质，参与多种脂质代谢反应，受LTP 基因家族编码调控[22]。后熟处理烟叶在烘烤过程中LTP1基因相对表达量均显著降低。烯醇辅酶a 还原酶（ECR）是合成超长链脂肪酸（VLCFA）所需的一种酶，在拟南芥中被证实参与了所有VLCFA 伸长反应，并被确定由CER10基因编码[23]。后熟处理烟叶CER10基因表达量下调，这可能与后熟处理后烟叶脂肪酸含量降低有关。MYB 是真核生物体内最大的转录因子家族之一，其成员在植物的生长发育、次生物质代谢、生物及非生物胁迫应答等多种生理过程中发挥重要作用[24]。有研究表明，MYB 转录因子可能参与了生物脂质合成调控，在脂质代谢调控网络中处于上游位置[25]。后熟处理烟叶中MYB48基因表达量降低，说明在烘烤过程中脂质合成受阻。

烟叶烘烤是脱水干燥的物理过程和内部生物化学变化过程的协调统一。提高烟叶烘烤质量除对烘烤工艺进行调整改善外，更重要的是要提升烟叶自身品质。上部叶存在烘烤品质差、可用性低问题的根本原因是，上部叶自身存在成熟度不够、内部化学成分不协调等生理缺陷。本研究利用后熟处理技术对上部叶进行处理，在提高烟叶成熟度、降低褐变程度和提高烤后烟等级等方面初见成效，并从生物细胞学、物质代谢和分子层面对其内在机制进行了初步探究。但对其复杂内在机制的研究仍有大量的不足，后期将通过基因克隆和转基因技术进一步深入研究。

本研究对后熟处理烟叶进行褐变程度分析、细胞超微结构观察、糖类和脂肪酸含量测定以及糖代谢和脂质代谢相关基因表达分析，并对烤后烟进行分级验证其实际效果，为通过后熟处理提高上部叶品质和可用性提供参考。

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