党治国 王海峰 司少魁

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SP)作为一种革兰氏阳性细菌,是肺炎最常见的病原菌,可导致高死亡率[1]。当感染肺炎后,肺部会出现较严重的炎性反应,作为呼吸道中对抗病原体的天然防线——肺泡上皮细胞会大量凋亡,造成肺损伤[2]。因此,探究SP诱导的肺泡上皮细胞凋亡的分子机制具有重要意义。研究表明,miRNA在肺泡上皮细胞凋亡中发挥重要的调控作用[3]。miR-671-5p作为一种miRNA,已有研究报道,过表达miR-671-5p可加重慢性肾病中的足细胞损伤[4]。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8-2(tumor necrosis factor-α induced protein-8-like 2,TIPE2),又称TNFAIP8L2,其为炎性反应和免疫稳态的关键调节因子,其可通过抑制炎症细胞浸润来抑制铜绿假单胞菌角膜炎[5]。本研究首先通过生物信息学分析miR-671-5p与TIPE2的关系及miR-671-5p对SP诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响和作用机制。

EMS系统是进行电力调度的能量管理系统。它主要运用在电网模型的简化和等值上，由于只是对系统模型的分析，其电力调度和电网监控强度值得商榷。实践是检验真理的唯一标准，EMS系统缺乏足够的实践监测经验，其数据的说服力不强。此外，EMS系统适用于相邻电网的模型分析，对具有实际意义的互联网电力系统中的电力调度工程分析，精确度和可靠度大为降低。

1.1 细胞来源 人肺泡上皮细胞HPAEpiC购自上海慧颖生物公司。

1.2 主要试剂 miR-671-5p抑制物(miR-671-5p inhibitor)及其阴性对照(inhibitor NC)、TIPE2小干扰RNA(si-TIPE2)及其阴性对照(si-NC)均购自厦门慧嘉生物公司;SP(货号:ATCC 49619)购自上海硕欣生物科技有限公司;CCK-8试剂盒(货号:CK04)购自深圳市纽邦生物公司;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒(货号:KGA105)购自江苏凯基生物公司;白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒(货号:EH004)购自上海吉泰依科赛生物公司;肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(货号:EK-H12145)购自博辉生物科技(广州)有限公司;白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA试剂盒(货号:JH-H10327)购自上海继和生物公司;兔源一抗TIPE2(货号:ab169616)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax;货号:ab182733)、半胱氨酸蛋白酶3(Cysteine proteinase3,caspase-3;货号:ab32351)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;货号:ab32124)、GAPDH(货号:ab9485)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(货号:ab205718)均购自Abcam公司。

1.3 SP诱导的HPAEpiC细胞模型的构建及分组 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,在37℃、5% CO2的条件下培养HPAEpiC细胞。取对数生长期的HPAEpiC细胞,分为Ctrl组、SP组、inhibitor NC组、miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组。inhibitor NC组、miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组分别利用LipofectamineTM2000试剂将inhibitor NC、miR-671-5p inhibitor、miR-671-5p inhibitor和si-NC、miR-671-5p inhibitor和si-TIPE2转染于HPAEpiC细胞,转染48 h后,6组分别再加入菌液1×108CFU/ml的SP处理24 h[6]。Ctrl组为未经任何处理的HPAEpiC细胞,SP组为未转染只用SP处理24 h的HPAEpiC细胞。

1.9 双荧光素酶报告基因实验 分别构建TIPE2野生型质粒(WT-TIPE2)及突变型质粒(MUT-TIPE2),将WT-TIPE2和MUT-TIPE2分别与mimic NC或miR-671-5p mimic共转染于HPAEpiC细胞,48 h后,检测荧光素酶活性。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖 细胞以1×104个/孔的密度接种到96孔板中,培养48 h时加入10 μl CCK-8试剂,室温孵育2 h后测量450 nm处吸光度。

When he was 4 years old，his father sent（送）him to school.The boys at school had lessons in Latin（拉丁语）and Greek（希腊语）.They had to work hard.If boys were naughty（调皮的），the teacher beat（打）them.Shakespeare and his friends played in the fields（田 野）.They went fishing and swimming in the river.

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 用胰蛋白酶消化6组细胞后,将细胞用冷PBS洗涤2次,然后重悬于1×结合缓冲液中,在室温下依次与5 μl FITC Annexin V和5 μl碘化丙啶避光孵育20 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡。

在肉牛养殖中，由于各种不良应激因素，如突然改变日粮、气候突变、饲料营养价值较差、饲料发霉变质、圈舍卫生环境不佳等因素存在，均会导致肉牛胃肠道疾病发生，防控不及时，某些传染性胃肠道疾病还会导致养殖场牛死亡率提升，损害养殖户经济效益。

1.8 Western blot检测蛋白表达 用RIPA裂解缓冲液提取各组细胞的总蛋白,将等量的蛋白质进行电泳、转膜、封闭后,加入一抗TIPE2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4℃下孵育过夜,再加入HRP标记的二抗孵育1 h,通过ECL试剂检测蛋白显色情况,Image J软件用于分析蛋白条带灰度值。

1.7 ELISA法检测细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平 严格按照试剂盒说明书检测细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.4 qRT-PCR检测miR-671-5p表达 Trizol试剂用于提取细胞中的总RNA,将RNA逆转录为cDNA后,以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测miR-671-5p的相对表达水平。miR-671-5p的相对表达水平是以U6为内参,通过2-ΔΔCt方法计算的。引物序列:miR-671-5p:正向引物5’-AGGAAGCCCTGGAGGG-3’,反向引物5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;U6:正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCATACT-3’,反向引物5’-ACGCTCTCACAATTTGCGTGTC-3’。

2.4 6组HPAEpiC细胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较 与Ctrl组比较,SP组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);与SP组、inhibitor NC组比较,miR-671-5p inhibitor组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05);与miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组比较,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。见表4。

2.1 6组HPAEpiC细胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表达比较 与Ctrl组比较,SP组细胞中miR-671-5p表达升高,TIPE2蛋白表达降低(P<0.05);与SP组、inhibitor NC组比较,miR-671-5p inhibitor组细胞中miR-671-5p表达降低,TIPE2蛋白表达升高(P<0.05);与miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组比较,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组细胞中miR-671-5p表达变化差异无统计学意义(P>0.05),TIPE2蛋白表达降低(P<0.05)。见图1,表1。

The Status Quo of China Provincial Tourism Image Positioning & Type Division_____________________________LU Xiaobo,CHEN Xiaoying,WANG Wanshan et al 1

图1 Western blot检测细胞中TIPE2蛋白表达;A Ctrl组;B SP组;C inhibitor NC组;D miR-671-5p inhibitor组;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC组;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组

表1 6组HPAEpiC细胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表达比较

2.2 6组HPAEpiC细胞增殖能力比较 与Ctrl组比较,SP组细胞OD450值降低(P<0.05);与SP组、inhibitor NC组比较,miR-671-5p inhibitor组细胞OD450值升高(P<0.05);与miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组比较,miR-671-5pinhi bitor+ si-TIPE2组细胞OD450值降低(P<0.05)。见表2。

树立正确的水生态观。贯彻党的十八大和十八届三中全会精神，坚持“系统治理”，统筹山水林田湖各要素，协调解决水资源、水环境、水生态、水灾害问题，牢固树立生态文明理念，大力推进水生态文明建设，构建水生态文明与经济社会成果交相辉映的新型人水关系。实施赣抚连通工程，构建赣江、抚河下游江河湖库水系连通体系，提升水资源调蓄能力、水环境自净能力和水生态修复能力。抓好南昌、新余等全国水生态文明城市建设试点，在莲花、会昌等县开展省级试点，并配合全省“百强镇”建设开展水生态文明示范镇、示范村建设。探索建立水生态补偿制度，引导社会资本投入水生态文明建设。通过以点带面，推进全省水生态文明建设。

表2 6组细胞OD450值比较

2.5 6组HPAEpiC细胞中凋亡相关蛋白表达比较 与Ctrl组比较,SP组细胞中Bax、caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与SP组、inhibitor NC组比较,miR-671-5p inhibitor组中Bax、caspase-3蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);与miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组比较,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组中Bax、caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。见图3,表5。

表3 6组细胞凋亡率比较

Ctrl组 SP组 inhibitorNC组

表4 6组HPAEpiC细胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较

2.3 6组HPAEpiC细胞凋亡率比较 与Ctrl组比较,SP组细胞凋亡率升高(P<0.05);与SP组、inhibitor NC组比较,miR-671-5p inhibitor组细胞凋亡率降低(P<0.05);与miR-671-5p inhibitor组、miR-671-5p inhibitor+ si-NC组比较,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图2,表3。

图3 western blot检测细胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白;A Ctrl组;B SP组;C inhibitor NC组;D miR-671-5p inhibitor组;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC组;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2组

表5 6组细胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白表达比较

2.6 miR-671-5p靶向调控TIPE2 Targetscan预测miR-671-5p与TIPE2存在结合位点,与mimic NC和WT-TIPE2共转染组比较,miR-671-5p mimic和WT-TIPE2共转染组细胞荧光素酶活性降低(P<0.05);与mimic NC和MUT-TIPE2共转染组比较,miR-671-5p mimics和MUT-TIPE2共转染组细胞荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图4,表6。

场地土层属于同一地貌单元，场地中地基岩土层分布稳定，总体上看层底面坡度<10%，除河沟地段地层有缺失外，各地基土分布相对连续，土体垂向压缩性相差较小，结合基础开挖深度及建筑物持力层情况，综合判断地基为均匀地基。

图4 Targetscan预测miR-671-5p与TIPE2的结合位点

表6 荧光素酶活性比较

肺炎是一种全球常见的感染性疾病,也是感染患者的主要死亡原因[7]。SP是一种革兰氏阳性需氧双球菌,最初定植于鼻咽,然后侵入下呼吸道,引起肺炎[8]。而肺炎可以引起肺上皮细胞凋亡以及炎性反应[9]。IL-6、TNF-α、IL-1β作为常见的炎性细胞因子,已有研究发现,IL-6、TNF-α、IL-1β在肺炎患者的血浆中高表达[10]。Bax、caspase-3、Bcl-2是评估细胞凋亡的常用指标,Bax、caspase-3具有促进细胞凋亡的作用,而Bcl-2在细胞凋亡中发挥抑制作用[11]。本研究利用SP诱导肺上皮细胞HPAEpiC以构建体外肺炎细胞模型,结果显示,与Ctrl组比较,SP组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平、Bax、caspase-3蛋白表达升高,而OD450值、Bcl-2蛋白表达降低,提示SP诱导的HPAEpiC细胞大量凋亡,细胞增殖能力减弱,且存在炎性反应。

miRNA是一种非编码RNA,在基因转录和翻译中起转录后调控作用。它可以调节靶基因的转录后表达,在生物发育、繁殖、细胞分化、细胞凋亡和发病机制中发挥着至关重要的作用[12]。研究发现,miRNA可以调节多种生命活动,并且多种miRNA已被证明参与调节炎性反应和炎症性疾病[13]。已有研究显示,过表达miR-671-5p可减轻缺血再灌注引起的神经炎症[14]和IL-1β介导的软骨细胞凋亡、炎症损伤[15];芍药苷通过上调miR-671-5p抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞炎性反应[16]。本研究结果显示,miR-671-5p在SP诱导肺上皮细胞HPAEpiC中高表达,下调miR-671-5p可抑制SP诱导的HPAEpiC细胞炎性反应及细胞凋亡,促进细胞增殖。本研究结果与先前研究的不一致可能是由于miR-671-5p存在组织特异性表达造成的。

TIPE2基因位于1号染色体(1q21.2～1q21.3)上,其是一种炎症负调节剂,可维持免疫稳态[17]。有研究报道,TIPE2在骨质疏松症患者中低表达,并且与促炎细胞因子呈负相关[18];肺炎支原体肺炎患儿外周血单个核细胞TIPE2水平明显降低,TIPE2可能是影响肺炎支原体肺炎发生的独立危险因素[19];参芪固本颗粒配合GINA阶梯方案治疗肺脾肾虚型支气管哮喘疗效显著,其机制与上调外周血单个核细胞中TIPE2表达,抑制炎性反应有关[20];TIPE2过表达显著减轻了急性肺损伤小鼠肺部炎症,并抑制肺细胞凋亡[21]。表明TIPE2具有抑制炎性反应及细胞凋亡的作用。本研究结果与上述研究一致的,本研究结果显示,TIPE2蛋白在SP诱导的HPAEpiC细胞中低表达,而下调miR-671-5p可促进SP诱导的HPAEpiC细胞中TIPE2蛋白表达,推测下调miR-671-5p可能通过促进TIPE2表达抑制SP诱导的HPAEpiC细胞凋亡及炎性反应。为了验证该推测,本研究在转染miR-671-5p inhibitor的基础上再加上TIPE2小干扰RNA进行干预SP诱导的HPAEpiC细胞,结果显示,沉默TIPE2减弱了下调miR-671-5p对SP诱导的HPAEpiC细胞凋亡及炎性反应的抑制作用。

综上所述,下调miR-671-5p通过促进TIPE2表达抑制SP诱导的HPAEpiC细胞凋亡及炎性反应,揭示了miR-671-5p在SP诱导的HPAEpiC细胞凋亡及炎性反应中的促进作用,表明miR-671-5p可能成为治疗SP诱导的肺炎的有希望的治疗靶点。

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