高 莹 郭兆安 刘迎迎 姬亚敏 刘 充 李瑞丰

1.山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014；
2.山东中医药大学附属医院 山东省中医院肾病科，山东济南 250014；
3.山东省菏泽市中医院肾病科，山东菏泽 274000；
4.山东中医药大学中医学院，山东济南 250014

高磷血症是终末期肾脏病最常见的并发症之一，是导致慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）患者低钙血症[1]、血管和组织异位钙化、继发性甲状旁腺功能亢进和慢性肾脏病矿物质及骨代谢紊乱的常见因素之一[2]，是影响CRF患者预后的要素之一[3]。我国约73%的血液净化患者血磷水平＞1.45 mmol/L，其中约90%的患者经饮食控制和透析治疗仍无法将血磷控制在正常范围内，需口服降磷药物治疗[4]。此前研究认为海螵蛸改善钙磷代谢主要与碳酸钙有关[5-6]，且具有双向调节钙磷代谢的优点[7-9]。单用海螵蛸具有服用不便及味道欠佳的缺点，而常用于改善胃肠道不适的快胃片以海螵蛸为主要成分，因此推断其亦具有改善钙磷代谢紊乱的作用。故本研究拟观察快胃片联合祛毒颗粒对CRF合并高磷血症大鼠钙磷代谢紊乱的疗效，并从成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF-23）、1，25-二羟维生素D3[1，25-（OH）2D3]和血清koltho方面对其机制进行探索。

1.1 实验动物

6周龄雄性SPF级SD大鼠，体重150±20 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[SCXK（鲁）20190003]。SPF级屏障环境内饲养，自由摄食饮水，定时添加饲料及更换垫料。本实验经山东省中医院伦理委员会审批（编号：AWE-2019-005）。

1.2 动物造模及分组

大鼠适应性饲养1周。随机取出10只行假手术并常规饲养，记为sham组。另40只以5/6肾切除法联合高磷饮食（磷含量1.03%）喂养4周，建立CRF合并高磷血症模型。按sham组数据的95%可信区间制订参考值范围，造模成功后采用随机数表法分为模型组（M组）、祛毒颗粒+碳酸钙D3咀嚼片组（C组）、祛毒颗粒+低剂量快胃片组[L组：34 mg（0.2 ml）/20 g大鼠体重]、祛毒颗粒+高剂量快胃片组[H组：68 mg（0.2 ml）/20 g大鼠体重]，每组10只。

1.3 主要试剂及仪器

FGF-23、klotho、1，25-（OH）2D3ELISA试 剂盒，购自上海赫澎生物试剂公司；
全自动生化分析仪，贝克曼AU5800；
3D全景扫描仪，3D HISTECH Pannoramic250。

1.4 试验用药

快胃片（上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，国药准字Z37021099，规格：0.7 g/片，2×12片/板/盒），碳酸钙（惠氏制药有限公司，国药准字H10950029，药品规格：复方，每片含钙1.5 g、维生素D3125 U，60片/瓶），祛毒颗粒组方：大黄12 g、党参30 g、黄芪30 g、石韦30 g、薏苡仁30 g、熟地黄30 g、鸡血藤30 g、川牛膝30 g、砂仁9 g、酒萸肉12 g、当归15 g、枸杞子15 g，由山东省中医院提供。

1.5 给药方法

sham组和M组：2 ml/d生理盐水灌胃，2次/d，2次间隔1 h。治疗组：祛毒颗粒1.8 g（0.2 ml）/20 g大鼠体重灌胃（成人等效剂量，水提浓缩）；
在此基础上，C组给予碳酸钙18.2 mg（0.2 ml）/20 g大鼠体重灌胃（成人药量2倍），L、H组分别给予快胃片34、68 mg（0.2 ml）/20 g大鼠体重灌胃（成人药量3、6倍）。两种药物灌胃间隔1 h，共给药4周。

1.6 观察指标

1.6.1 肾功能相关指标 给药前、后采用生化法测定尿蛋白/尿肌酐（albuminuria creatinine ratio，ACR），全自动生化仪检测血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.6.2 疗效相关指标 采用全自动生化仪检测血钙（calcium，Ca）、血磷（phosphorus，Pi）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）。

1.6.3 机制相关指标 采用ELISA试剂盒检测血清FGF-23、1，25-（OH）2D3和klotho。

1.6.4 肾脏组织学检测 实验结束时取肾脏组织，处理后行HE、PAS染色下光镜检测及透射电镜检测。

1.6.5 FGF-23半定量分析 使用Quant Center 2.1软件定量切片目的区域的H-Score，H-SCORE=∑（PI×I）（PI：阳性信号像素面积占比，I：着色强度）。

1.7 统计学分析

数据分析采用SPSS 25.0。正态分布计量资料表示为均数±标准差（），组间比较采用单因素方差分析、组内比较采用配对t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

造模过程中，sham组大鼠术后不明原因死亡2只；
40只造模大鼠中5只因手术死亡，3只指标未达到造模目的。给药过程中死亡4只，其中M组2只、C组和H组各1只。造模完成后，与sham组相比，各造模组大鼠ACR、SCr、BUN、Pi、PTH、ALP及FGF-23水平升高，Ca、klotho和1，25-（OH）2D3水平降低，差异均有统计学意义（P＜ 0.05），且各造模组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.1 给药前后肾功能相关指标比较

给药组大鼠的肾功能相关指标比M组及同组给药前均明显降低，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），但给药组间比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表1。

表1 给药前后肾功能相关指标比较（±s）

表1 给药前后肾功能相关指标比较（±s）

注 与sham组相比，△P＜ 0.05、△△P＜ 0.01；
与M组相比，＊P＜ 0.05、＊＊P＜ 0.01；
ACR：尿蛋白/尿肌酐；
Scr：血肌酐；
BUN：血尿素氮

组别 n 时间 ACR（g/gcr） Scr（umol/L） Bun（mmol/L）sham组 8 给药前 2.21±0.73＊ 59.26±8.87＊＊ 8.39±1.48＊＊给药后 2.97±0.93＊＊ 56.55±6.01＊＊ 8.54±1.34＊＊M组 6 给药前 13.46±3.17△ 120.96±40.35△△ 18.89±5.22△△给药后 23.43±5.87△△ 143.02±20.77△△ 19.29±2.65△△C组 7 给药前 12.67±2.45△ 121.08±22.16△△ 17.90±4.07△△给药后 6.82±3.84＊＊ 99.72±15.07＊＊ 13.94±1.87＊＊L组 8 给药前 12.29±2.84△ 121.08±32.44△△ 17.26±6.04△△给药后 6.13±3.46＊＊ 99.41±11.81＊＊ 14.11±1.74＊＊H组 7 给药前 13.18±2.40△ 123.80±27.21△△ 18.34±3.89△△给药后 6.78±2.72＊＊ 86.62±14.76＊＊ 13.29±1.67＊＊F值 给药后 50.984 28.343 27.383 P值 给药后 0.000 0.000 0.000

2.2 给药前后疗效相关指标比较

与M组相比，给药组大鼠的Pi、PTH及ALP水平降低，Ca水平升高，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）。L组与C组大鼠的疗效相关指标差异无统计学意义（P＞ 0.05）；
与C组相比，H组大鼠Ca水平较高，而PTH水平较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 给药前后疗效相关指标比较（±s）

表2 给药前后疗效相关指标比较（±s）

注 与sham组相比，△△P ＜ 0.01；
与M组相比，＊＊P＜ 0.01；
与C组相比，▲P＜ 0.05；
Pi：血磷；
Ca：血钙；
PTH：甲状旁腺激素；
ALP：碱性磷酸酶

组别 n 时间 Pi（mmol/L） Ca（mmol/L） PTH（pg/ml） ALP（U/L）sham组 8 给药前 2.37±0.19＊＊ 2.43±0.07 5.80±1.14＊＊ 171.60±24.53＊＊给药后 2.55±0.34＊＊ 2.47±0.14＊＊ 5.49±0.21＊＊ 173.50±32.29＊＊M组 6 给药前 3.19±0.27△△ 2.08±0.41△△ 9.59±0.26△△ 230.90±19.02△△给药后 3.85±0.22△△ 2.11±0.04 13.98±0.42△△ 329.10±34.74△△C组 7 给药前 3.27±0.34△△ 2.07±0.11 9.26±1.43△△ 231.70±27.93△△给药后 2.61±0.28＊＊ 2.36±0.08＊＊ 7.45±0.45＊＊ 239.80±30.75＊＊L组 8 给药前 3.01±0.18△△ 2.11±0.15 9.18±0.39△△ 238.50±27.32△△给药后 2.60±0.54＊＊ 2.33±0.07＊＊ 7.29±0.78＊＊ 240.00±33.86＊＊H组 7 给药前 3.15±0.12△△ 2.09±0.28 9.62±0.80△△ 232.00±38.77△△给药后 2.59±0.57＊＊ 2.54±0.09＊＊▲ 6.90±0.35＊＊▲ 246.20±58.79＊＊F值 给药后 18.624 33.525 469.657 19.616 P值 给药后 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 给药前后机制相关指标比较

M组大鼠与自身给药前相比，FGF-23明显升高、klotho降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），1，25-（OH）2D3差异无统计学意义（P＞ 0.05）；
给药组大鼠与同组给药前相比，FGF-23水平下降，1，25-（OH）2D3和klotho水平明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 给药前后机制相关指标比较（±s）

表3 给药前后机制相关指标比较（±s）

注 与sham组相比，△△P ＜ 0.01；
与M组相比，＊＊P＜ 0.01；
与C组相比，▲P＜ 0.05；
FGF-23：成纤维细胞生长因子23；
1，25-（OH）2D3：1，25-二羟维生素D3

组别 n 时间 FGF-23（ng/ml） 1，25-（OH）2D3（ng/ml） klotho（pg/ml）sham组 8 给药前 35.85±2.87 154.01±7.29＊＊ 4296.20±297.60＊＊给药后 33.28±2.58＊＊ 168.19±9.92＊＊ 4418.20±243.78＊＊M组 6 给药前 68.35±4.41△△ 69.29±7.10△△ 2297.70±128.46△△给药后 87.28±3.77 57.47±13.73△△ 1732.50±200.35△△C组 7 给药前 61.08±5.10△△ 61.82±4.92△△ 2317.30±136.44△△给药后 56.07±2.03＊＊ 98.61±23.20＊＊ 1903.20±237.86＊＊L组 8 给药前 73.30±1.94△△ 57.72±8.74△△ 2358.00±203.38△△给药后 57.36±2.22＊＊ 100.78±20.11＊＊ 1918.30±280.21＊＊H组 7 给药前 74.38±5.60△△ 63.96±7.66△△ 2359.00±172.81△△给药后 51.34±3.30＊＊ 124.85±14.01＊＊▲ 1991.90±295.79＊＊F值 给药后 462.568 47.589 140.992 P值 给药后 0.000 0.000 0.000

2.4 肾脏病理变化

2.4.1 HE染色 sham组大鼠肾脏组织未见明显异常。M组大鼠肾脏组织皮髓质分界不清，局部被膜结缔组织增生，大量肾小管上皮细胞肿胀，较多肾小管扩张，形成蛋白管型。肾小球结构紊乱，系膜增生严重。肾间质可见大量炎症细胞浸润。给药组大鼠肾脏HE染色损伤情况相近且轻于M组。见图1。

图1 肾脏组织HE染色病理图片（200×，1∶50μm）

2.4.2 PAS染色 对PAS阳性面积与肾小球总面积的比值的检测显示，sham组＜C组≈L组≈H组＜M组。见图2。

图2 肾脏组织PAS染色病理图片（400×，1∶20μm）

2.4.3 透射电镜 sham组大鼠足细胞基本正常，偶可见轻度水肿。M组大鼠足细胞趋于坏死，细胞核溶解；
线粒体严重肿胀，空泡化，嵴断裂消失；
基底膜结构较模糊、疏松，不规则增厚；
足突局部融合或消失。给药组损伤情况轻于M组。滤过屏障损伤程度：M组＞C组≈L组≈H组＞sham组。见图3。

图3 肾脏组织电镜下图片（2500×，1∶5.0μm）

2.5 FGF-23半定量分析

FGF-23在肾脏表达：M组＞C组≈L组＞H组＞sham组。见图4。

图4 FGF-23在肾脏组织中的表达（200×，1∶50 μm）

高磷血症在CRF患者中较常见[10]，会增加血管钙化和心血管意外风险[11]，且血液透析患者还可因严重高磷血症和继发性甲状旁腺功能亢进引起继发性肿瘤及钙化[12]。目前高磷血症的治疗主要为采用药物抑制肠道吸收磷，常存在疗效欠佳、安全性不高或经济紧张等问题，影响临床使用，且国内缺乏被广泛认可的治疗高磷血症的中成药。

快胃片的药物组成为海螵蛸、白矾（煅）、白及、延胡索（醋制）、甘草，海螵蛸作为快胃片的君药，可双向调节钙磷代谢紊乱[7-9]。本研究显示，快胃片联合祛毒颗粒可纠正钙磷代谢紊乱问题，且高剂量快胃片升高Ca的水平更强。祛毒颗粒为郭兆安教授临床经验组方，既往研究显示祛毒颗粒可降低肾间质纤维化面积、减轻肾小管损伤[13]、减轻肾小球硬化[14]，从而保护肾功能[15]。本研究再次证明了祛毒颗粒对肾功能的保护作用。

FGF-23和klotho是继PTH、1，25-（OH）2D3之后慢性肾脏病矿物质及骨代谢紊乱重要的参与因子[16]。FGF-23可通过其共受体α-klotho调节肾脏对磷酸酯的重吸收和1，25-（OH）2D3的生成[16]。klotho蛋白具有调节钙磷代谢、调控细胞凋亡、调节氧化应激与炎症等作用[17]。有研究发现血清klotho表达水平与血钙、血磷水平呈负相关[18]。FGF-23/KL轴与Pi、PTH、1，25-（OH）2D3的水平及CKD后期并发症的发生发展息息相关[19]。本研究结果显示，快胃片联合祛毒颗粒可降低FGF-23、升高1，25-（OH）2D3和klotho，故考虑快胃片联合祛毒颗粒可能通过调节FGF-23/KL轴调节钙磷代谢紊乱。同时本研究结果显示，H组效果优于C组，且快胃片升高Ca作用与剂量相关，但快胃片升高Ca的同时是否会带来血管钙化的风险尚需更长时间的观察。

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